真核细胞转染及筛选稳定转染细胞系

真核细胞转染及筛选稳定转染细胞系

简介：
天津赛尔生物可以获得稳定转染的并且表达某种蛋白的克隆细胞服务
 
1、脂质体转染
原理：将需转移的DNA 或RNA 包裹于脂质体，通过脂质体与细胞膜的融合将DNA 或RNA 转入宿主细胞内。因此，细胞膜通透性高的细胞，脂质体复合物较易进入，转染效率较高；而有的细胞系本身就不容易被转染。
2、电穿孔转染
原理：电流能可逆地击穿细胞膜形成瞬时的水通路或膜上小孔促使DNA 分子进入胞内。优势：细胞范围广，无论悬浮细胞还是贴壁细胞，均能被有效转染。缺点：高电场强度会对细胞具有较强的杀伤效应。
目前本公司正在引进更为先进的电穿孔仪，能够有效减轻对细胞的杀伤作用。
3 、腺病毒感染
对于脂质体和电穿孔都无法转染的细胞，可采用腺病毒感染的方式进行目的分子的导入。优点：感染效率高。缺点：只能瞬时表达。

服务内容：
一、确认细胞对质粒载体或腺病毒载体的转染效率
二、转染携带目的基因的质粒载体，G418 筛选（或流式细胞分选）后建立稳定表达细胞株
三、对携带目的基因的载体（质粒载体或腺病毒载体）进行相关检测实验

具体操作：
一、细胞转染效率的确定：
1 、将目的细胞以合适的数目接种于24 孔板中（一般为1 ×105 细胞/ 孔）；
2 、第二天转染质粒载体（携带报告基因EGFP ）：采用的脂质体购自Invitrogen 公司；
   或感染携带报告基因EGFP 的腺病毒载体；
3 、感染后48h 流式细胞检测EGFP 的表达，明确其转染或感染效率；
（携带报告基因EGFP 的载体可由本公司提供）
二、稳定表达细胞株的建立
1 、将转染后的细胞按照一定的比例接种到6 孔板中（一般选用1 ：10 和1 ：100 两个梯度），分别采用1200 m g/ml ，1000 m g/ml 和800 m g/ml 的G418 进行筛选；
以转染携带EGFP 质粒载体的细胞作为阳性对照，以未转染质粒载体的细胞作为阴性对照；
2 、每3 ～4 天换液一次；
3 、筛选20 ～30 天，即可得到稳定表达细胞株；
4 、传代后，以一定的G418 浓度维持培养；
三、对携带目的基因的载体（质粒载体或腺病毒载体）进行相关检测实验

检测项目：
（一）蛋白表达的检测
1 、流式细胞检测膜蛋白的表达；
2 、ELISA 检测分泌型蛋白的表达；
3 、Western-blot 检测其他蛋白的表达；
（二）细胞凋亡检测（流式细胞检测）
（三）细胞增殖检测（MTT 法或CCK8 法）
（四）细胞迁移检测
（五）信号通路研究（Western-blot 或Real-time ）
 
客户须知：
1．一般情况下细胞的转染效率达到50%，我们才可以成功进行后续检测实验。如果在25%-40%，可以进行G418瞬时筛选，低于25%也可以做G418的稳定筛选，大部分情况下我们都会建议用大流式细胞仪进行筛选，此方法既快速又方便，而且可以得到100%的阳性细胞，一般经过大流式筛选的细胞做后续基因水平或蛋白水平检测都可以得到理想的结果。
2．客户需提供高效率毒性低的转染试剂（质脂体）或购买我们公司代理的德国Biontex公司脂质体转染试剂（此试剂转染效率中上等优点是毒性低）。
3．如客户提供细胞系转染效率达到50%，我们可以顺利快速进行实验，约1－2个工作日就可完成此实验。如客户提供细胞系转染效率低于50％，我们就要进行1－2个工作日的
G418的筛选实验，转染效率低于25％，无论做G418的稳定筛选还是大流式筛选实验时间都将推后2－3个工作日。
 
赛尔生物相关服务：
MicroRNA相关服务siRNA干扰课题整体外包服务基因克隆服务慢病毒包装服务腺病毒服务稳定细胞株筛选服务蛋白表达服务抗体制备服务DNA与蛋白相互作用研究噬菌体展示技术服务cDNA文库构建干细胞研究基金申请，标书撰写，专利申请，课题设计等
 
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