细胞流式凋亡

                      细胞流式凋亡

    流式细胞技术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。
           

一、固定细胞的染色方法
1）PI单染色法
方法一
1．收集细胞（1～5）×106个，500～1000r/min离心5min，弃去培养液。
2．3ml PBS洗一次。
3．离心去PBS，加入冰预冷的70％的乙醇固定，4℃，1h。
4．离心弃去固定液，3ml PBS重悬5min。
5．400目的筛网过滤1次，500～1000r/min离心5min，弃去PBS。
6．用1ml PI染液，4℃避光30min。
7．流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光，可分析前散射光对侧散射光的散点图及PI荧光的直方图。
天津赛尔HeLa流式凋亡

2）调亡细胞的TUNEL的流式细胞仪分析
1．离心收集细胞，PBS洗1～2次。
2．1％多聚甲醛低温下固定15min。
3．3ml PBS洗1次，70％乙醇固定，冰箱内放置1～3天。
4．PBS轻洗1次
5．细胞与TdT标记液37℃孵育，时间1～2h。
6．PBS轻洗1次。
7．细胞在黑暗中37℃与100μl的染色缓冲液孵育30min。
8．含0.1％Triton-X 100的PBS轻洗1次。
4．500～1000r/min离心5min弃去固定液，室温加入含0.2％Tween的PBS 1ml，37℃孵育15min。
5．1ml PBS/FCS洗3次，每次5min。
6．400目的筛网过滤1次。
7．500～1000r/min离心5min去PBS/FCS，用1.0ml PI染液，4℃避光至少30min。染色在24h之内皆可行，流式细胞仪分析。

二：操作注意事项
1、补偿对照管很重要;
2、细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞;
3、细胞浓度与染色用的蛋白量要合适;
4、对不同药物浓度和药物作用时间要进行摸索;
 
三：仪器：
实验所用的流式细胞仪为COULTER EPICS XL。
送检样本量：
1）单个细胞：1~2×106 个细胞左右;来源于人、小鼠、大鼠或其它。
2）外周血：EDTA或肝素抗凝全血，5ml左右;来源于人、小鼠、大鼠或其它。
1、部分常用荧光探针，如PI等，我公司可免费提供，;特殊标记物，如CD抗体等，用户须另行购买，也可委托我公司代购;用户所提供抗体应可与样本发生特异性识别反应。
2、由用户提供的样品或试剂所致的实验问题由用户负责。
 
附：流式细胞术检测样品推荐制备方法：
细胞周期、细胞凋亡及DNA倍体分析样品（PI染色）的制备：
（1）待测样本制成单细胞悬液，然后200g离心5分钟，弃上清。
（2）用4℃预冷的70%冷乙醇固定，4℃保存，至少固定18小时。
（3）调整细胞浓度为106细胞/毫升，取1毫升细胞悬液，用PBS洗三次，细胞重悬于1毫升PI染液中，37℃孵育30分钟即可进行流式分析。
（4）PI染液终浓度为50微克/毫升，RNase A终浓度为20微克/毫升。
 
四：流式细胞术检测凋亡注意事情：
1. 附着细胞的凋亡研究：在悬液中的细胞比贴壁细胞更容易发生凋亡，建议在用胰蛋白酶处理前单独收集培养液中悬浮的细胞。
2. 固定剂的影响：在做DNA断裂片段分析凋亡细胞时(如APO-BRDU、APO-DIRECT)，要注意使用化学固定剂(如多聚甲醛)固定细胞，使DNA交联。原因是：在洗细胞的步骤中，未固定的细胞可能会丢失小的DNA片段，而使用化学试剂固定后的细胞，小DNA片段就不会丢失。建议做DNA断裂片段分析细胞系时，比较不同的固定剂和破膜剂的效果。
3. 为了减少细胞丢失，染色、分析时建议使用12×75mm聚苯乙烯管。其它类型的试管(如聚丙烯管)，会使细胞在管壁堆积，造成细胞丢失，并影响染色效果。洗细胞后，建议轻轻药匀细胞沉淀，避免使用加液枪，以免由于塑料枪头的使用造成细胞损失。
4. 洗细胞时应注意应洗到管壁内侧细胞可能附着的位置，使细胞充分悬浮。这样可以避免在随后的染色步骤中，由于细胞贴壁或悬着不充分，造成细胞染色不均一。如果细胞染色不均，在荧光参数分析时，表现为双峰现象，即多出一群着色弱的细胞。
5. 做APO-BRDU或APO-DIRECT分析时，若发现染色荧光若，可以适当延长BrdU掺入反应的时间。一些细胞的反应时间可以到37°C 4小时。
6. 做APO-BRDU或APO-DIRECT分析时，可以结合PI染色，研究凋亡与细胞DNA周期的关系。

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