CRISPR/Cas9基因敲除稳定细胞系构建

项目介绍
利用Crispr-Cas9基因编辑技术进行目的基因敲除细胞系的构建。


技术原理
CRISPR/CAS9基因敲除稳定细胞系构建技术原理介绍CRISPR/Cas9系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制，此系统被成功改造为第三代人工核酸内切酶，用于基因组编辑的工具使用，利用该系统，我们可以进行各种复杂基因组的编辑。CRISPR/Cas9系统的工作原理是crRNA（CRISPR-derived RNA）通过碱基配对与tracr-RNA（trans-activating RNA）结合形成tracrRNA/crRNA复合物，该复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA（short guide RNA），以引导Cas9对DNA的定点切割。我们拥有完善的 CRISPR/Cas9 载体系统，包括单敲除，双敲除，缺口酶、慢病毒敲除载体和敲除载体库等体系。并且每一个载体系统都有不同的标签（EGFP/RFP/Puro/Neo）可供选择。同时，拥有 100 余种基因敲除的项目经验，可以快速、准确、高效的完成任何一个基因敲除的项目。




结果展示


    Crispr-Cas9 基因敲除细胞株构建流程



将sgRNA克隆至表达质粒并转染293T细胞，72h后分选阳性细胞，抽提基因组DNA，进行T7E1检测，筛选切割效率最高的5’sgRNA-3用于后续质粒构建。



质粒转染细胞，72小时后通过荧光标签将阳性细胞分选至96孔板中进行单克隆培养。



单克隆株PCR鉴定：针对目的基因序列设计基因型鉴定引物，正反向引物设计在敲除片段两端，Control组通过PCR能够扩增出1065bp的片段,基因敲除组通过PCR能够扩增出219bp的片段。



  将PCR鉴定正确的样品进一步进行测序鉴定

实验案例：

1、设计针对 Atg10基因的 gRNA并克隆到吉锐生物的 pGK1.1敲除载体中；
2、电转 pGK1.1（Atg10）载体至 K562细胞中；
3、Cruiser™酶切计算突变率（图1）；
4、单克隆筛选用 Cruiser™酶切验证获得潜在阳性克隆（图2）；
5、对潜在的阳性克隆进行测序验证，获得纯合子；

图1. Cruiser™酶切细胞池，计算突变率。

图2. Cruiser™筛选单克隆细胞，获得潜在的阳性克隆。

图3. 潜在阳性克隆测序比对结果

根据潜在阳性克隆单克隆测序验证结果，判断该株疑似阳性克隆的两个亲本都缺失11bp碱基，该株阳性克隆为纯合子敲除细胞株。

我们的优势

1、提供各种实验材料和仪器，满足项目课题实验需要。
2、专业的操作人员。
3、高规格实验室。
4、数据结果交付周期快。
5、完善的服务体系，全程跟进，确保满意。

服务流程

1、提交项目课题相关需求和资料。
2、与我们的专业技术团队讨论项目细节。
3、根据讨论后的意见对实验方案进行修改。
4、双方均满意并达成一致，签订技术服务合同。
5、开展实验，按期完成合同规定的内容。
6、结题，提供实验原始结果和分析结果、实验流程、实验条件等等。

常见问题解答：

Q-1：靶位点设计有哪些注意事项？
A-1：目前有几个在线设计软件，我们推荐使用 Zhang Fenglab：http://crispr.mit.edu/，该软件会对每一个潜在的靶位点打分，并告知是否存在脱靶现象。在设计Guide 序列时，需要特别注意第一个碱基必须是G，如果您选取的Guide 序列的第一个碱基不是G，需要自行加上一个G，因为这个G 对于起始转录非常重要。

Q-2：单个细胞不生长，怎么办？
A-2：对于单细胞不长的细胞进行敲除，首先建议采用共培养的方法看看能否促进单个细胞的生长。共培养可以采用培养过同种细胞的培养基培养单细胞；也可以使用 Cell Plaza（单细胞培养板），可以把细胞的存活率提高三倍以上。如果以上方法都不行，建议对细胞进行改造，加快其分裂速度，让单细胞可以很容易生长后，再对目的基因进行敲除。具体方法可以联系Genloci 的客服做进一步的了解。

Q-3：KO项目评估可行性最基本的要求是什么？
A-3：基因方面：基因是非致死基因且敲除后对细胞生长影响不大； 细胞方面：单克隆可以生长、电转效果大于30%等。

Q-4：如果靶细胞转染效率低，怎么办？
A-4：因为 Cas9 蛋白比较大，就导致整个敲除质粒较大（10kb 左右），如此大的质粒，再加上是使用脂质体等化学试剂转染时，就会很容易导致转化效率低下。所以，我们推荐使用电转的方法进行转染。Bio-Rad 的电转仪器需要根据不同的细胞单独配制转染buffer，所以不推荐使用；Life 的Neon 系统不错，但是因为耗材是镀金的，所以非常贵；而Genloci 的CTX-1500A 电转仪，转化效率高，不需要单独配制buffer，只需使用无血清的培养基就行，而且该电转仪的耗材也是相对比较便宜的。

Q-5：gRNA靶位点设计的评分越高，说明敲除效率越高吗？
A-5：评分只代表靶位点特异性，而不是代表敲除效率，所以任何情况下是无法保证敲除效果的；评分越高说明靶位点特异性越好！

Q-6：最后拿到敲除的稳定株系是否为永久敲除，能否稳定传代？
A-6：筛选出的阳性克隆为永久敲除，并且可稳定遗传。

Q-7：后期筛选的阳性克隆鉴定都用什么技术呢？
A-7：初步筛选用我们公司自己的产品 Crusier 突变检测试剂盒，对于确定的阳性克隆，会进一步送测序，做TA 克隆，跟原序列比对碱基突变情况；同时根据客户需要，我们可以进行mRNA水平和WB 验证，可以客户提供抗体也可以我们代买抗体。

Q-8：在做高通量样本时，如何才能快速筛选得到阳性克隆？
A-8：建议使用错配酶进行筛选，可加快筛选的流程。目前市面上主要有三种错配酶：Cruiser 酶、T7E I 和Surveyor 酶。其中，Cruiser 酶和Surveyor 酶属于Cel I 家族，这两种酶的筛选特异性比T7E I 高。在酶切筛选过程中，T7E1 的特异性较差，容易出现假阳性的结果，这在一定程度上阻碍了阳性克隆的筛选。

Q-9：KO细胞可否保证目的基因蛋白WB检测结果？
A-9：保证在基因组水平和mRNA水平上敲除，对于WB，因抗体的非特异性等因素，不保证WB结果。  

参考文献

1.RNA-guided human genome engineering via Cas9. 2013. Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, Norville JE, Church GM. Science. 339(6121):823-6.
2.Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. 2013. Qi LS, Larson MH, Gilbert LA, Doudna JA, Weissman JS, Arkin AP, Lim WA. Cell. 152(5):1173-83.
3.Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. 2013. Ran FA, Hsu PD, Wright J, Agarwala V, Scott DA, Zhang F. Nat Protoc. 8(11):2281-308.

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