总RNA提取技术服务

                      总RNA提取技术服务

     RNA是生命活动中基因表达过程非常重要的生物大分子，如mRNA,它携带了DNA的全部编码信息。RNA的分离是研究基因功能的重要基础之一，在分子生物学中占有重要的地位。提取的mRNA可用于Northern blot、RT-PCR、构建cDNA文库、Gene Chips以及体外翻译等实验，在动物细胞内，所含RNA主要是rRNA(占80～85%)、tRNA及小分子RNA(占10～15%)和mRNA(占1～5%)。rRNA含量最丰富，由28S、18S和5S几类组成。mRNA种类繁多，分子量从数百至数千碱基不等，但绝大多数mRNA在3’端都有一个Poly-A尾巴，因此，可根据此特性用寡聚脱氧胸苷(Oligo dT)层析柱从总RNA中将mRNA分离出来。
  
 
    TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入CHCL3时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。

一、组织和细胞总RNA提取：

TRIzol法
TRIzol RNA提取试剂盒是由GIBCO BRL公司推出专供提取RNA的产品，其操作方便、快捷。
（一）试剂准备
1．TRIzol试剂。
2．CHCL3
3．异丙醇
4．75%乙醇（DEPC H2O配制）
5．DEPC H2O
（二）操作步骤
1．样品处理：
1  培养细胞：收获细胞1-5×10⁷，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，
室温静置5min。
2  组织：取50-100mg组织（新鲜或-80℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置５min。
3  加入0.2ml CHCL3，振荡15s，静置2min。
4  4℃离心，12000g×15min，取上清。
5  加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。
6  4℃离心，12000g×10min，弃上清。
7  加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。
8  晾干，加入适量的DEPC H2O溶解（65℃促溶10-15min）。
（三）注意事项
1．   样品量和Trizol的加入量一定要按步骤（1）的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。
2．  实验过程必须严格防止RNsae的污染。
 
Trizol法提取冻存组织总RNA
1  于—80℃取出组织，秤重，放入盛有液氮的保温杯中。
2  将组织放入研钵，倒入少量液氮，研磨至细粉状，其间不断加入液氮。
3  按每100mg组织加入1mlTrizol，此时Trizol呈固态，继续研磨，固态变为透亮的液态，液体转移至1.5 EP中，每管1ml, 冰上静置5min。
4  每管加入200ul -20℃预冷的CHCL3，混匀，冰上静置10min。
5  4℃top speed 20min.
6  转移上清至新管，每管加入1-2VL -20℃预冷的异丙醇（或1-4V -20℃预冷的乙醇），混匀，-20℃静置﹥2h。
7  4℃top speed 30min.
8  弃上清，每管加入1ml 70%或75%酒精，弹起沉淀，4℃top speed 10min。
9  重复8
10 弃上清，室温晾干，用DEPC-treated的水溶解，定量，电泳，-80℃保存。
 
二、总RNA定量
RNA定量方法与DNA定量相似。RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/ml的单链RNA。如用1cm光径，用ddH2O稀释DNA样品n倍并以ddH2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：
RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000
RNA纯品的OD260/OD280的比值为1.7-2.0，故根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示RNA有降解有散射效应。
RNA沉淀物不宜过于干燥，否则会降低溶解性，<1.6可能是RNA未充分溶解，加热到55-60℃并中度涡旋可提高RNA溶解率。
 
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