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免疫共沉淀实验技术(IP)一、原理:IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。 1、实验仪器:高速组织捣碎机:SWISS KINEMATIC Ltd. Co(型号:PT1600E)电泳仪:北京六一仪器厂(型号:DYY-8C)电泳槽:北京六一仪器厂(型号:DYCZ-24D)转印槽:北京六一仪器厂(型号:DYCZ-40D)低温高速离心机:Sigma 公司(型号:Sigma 2-16k)超低温冰箱: SANYO(型号:MDF-382E)分光光度计:上海尤尼柯(型号:WFZ-UV-2000)脱色摇床:上海琪特分析仪器有限公司(型号:STS-2)2、主要试剂:HRP标记山羊抗小鼠二抗:北京中山(货号:ZB-2305)蛋白质预染分子量marker:FermentasA蛋白-sepharose珠:Pharmacia Biotech公司产品NC膜:Millipore公司(型号:0.45um)化学发光底物底物:PIERCE公司电泳类生化试剂均为美国amresco公司产品其他生化试剂为国药集团上海化学试剂公司产品总蛋白测定试剂盒:南京建成生物工程研究所 二、操作流程1、样品准备1)取细胞加入500μl上样Buffer(无溴酚蓝)和50ul 10mg/ml PMSF,混匀,超声波破碎细胞2)4℃,12000rpm离心10min3)取上清夜,-70℃冻存24hr5)4℃12000rpm再次离心10min,取上清分装,一份用于定蛋白,另一份加入溴酚蓝(0.1%(W/V))后于100℃加热4min,后于-20℃保存待用。 2、定蛋白及计算电泳上样量根据总蛋白测定试剂盒说明书操作测定样本中的总蛋白含量,电泳上样量定为40ug 3、免疫沉淀1)准备A蛋白-Sepharose珠:用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠2)准备A蛋白-Sepharose珠.一抗复合物:按每50 μl A蛋白-Sepharose珠中加入10ul 一抗,4℃孵育1 h,8000rpm离心5 min,PBS洗涤3次,加50ulPBS3)取100 μg总蛋白,加入50ul A蛋白-Sepharose珠.一抗复合物,4℃轻摇2h,PBS洗涤3次,之后加入50ul 1×SDS凝胶上样缓冲液,100℃变性3 min,以游离抗原、抗体、珠子,8000 rpm室温离心5 min,蛋白上清储于-20℃备用。 4、电泳1)安装好电泳装置2)根据不同的指标配制相应浓度的分离胶,灌胶约3/5体积,液封(<10%用0.1%SDS,>10%用异丙醇)3)30min后,待凝后倾去封液4)配5%的浓缩胶,灌胶至距平板顶部2mm处,插入梳子, 30min后,待凝后拔出梳子,用去离子水清洗加样孔,用滤纸吸干5)上样:各样品取50ug上样,marker取10μl上样(上样前需按说明书进行预处理)6)缓慢加入内、外槽缓冲液,接通电源,90v电泳至指示剂进入分离胶后,调电压至150V继续电泳7)当指示剂距平板底端1cm处时停止电泳5、转膜及检测1)准备2个Φ12cm的平面皿,一个装去离子水浸泡NC膜20min,另一装转移缓冲液浸泡海绵和滤纸20min2)取下胶,切除浓缩胶部分后,将分离胶浸入转移缓冲液中约5min3)按顺序安装好转膜装置(黑色板-海绵-三层滤纸-凝胶-硝酸纤维膜-三层滤纸-海绵-红色板)4)完全排除气泡,4℃,100mA转膜2hr。5)倾去转膜缓冲液,拆除转膜装置,将硝酸纤维膜放入丽春红中摇床染色15min,用去离子水清洗至能看到条带,后用铅笔标出marker位置,再用去离子水震荡以去除浮色。在右上角剪去一角以辨上下左右6)将膜转移至另一容器中,用5%脱脂奶粉封闭, 4℃过夜7)将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的一抗8)37℃摇床孵育约2hr9)PBST洗涤4次,每次5min10)将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的二抗,37℃摇床孵育约30min11)PBST洗涤4次,每次5min12)将膜转移至尽可能小的容器中并加入预先配制好的化学发光底物(A液与B液等体积混和),室温孵育5min后13)取出NC膜,去尽残液,包好,放入X-光片夹中显影14)扫描及分析6、结果:用Quantity One 4.3.1(Bio-rad)软件对照片进行分析(注意:Trace表示Band光密度分布曲线下面积) 赛尔生物相关服务:MicroRNA相关服务siRNA干扰课题整体外包服务基因克隆服务慢病毒包装服务腺病毒服务稳定细胞株筛选服务蛋白表达服务抗体制备服务DNA与蛋白相互作用研究噬菌体展示技术服务cDNA文库构建干细胞研究基金申请,标书撰写,专利申请,课题设计等 联系咨询我们地址:天津市津南区小站镇黄台工业园嘉园道8号(华若英)官网:www.saierbio.com QQ:2774964243 QQ:58214061邮箱:info@saierbio.com 电话******8001手机******吴海东
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