全基因激活库的用途
CRISPR/Cas9作为当今基因编辑领域最热门的明星工具,自2014年以来,多篇CNS(Cell、Nature、Science)连续报道了基于CRISPR/Cas9的高通量筛选技术。本公司的基于CRISPR/Cas9的全基因激活库(人)可以用于药物靶标发现,药物敏感基因、耐药性基因、肿瘤细胞增殖关键基因、肿瘤转移基因、放疗耐受基因、细胞对致死致病原感染敏感关键基因的高通量功能性筛选等。
全基因激活库(人)介绍
全基因激活库(人,Human CRISPR Activation Library(SAM - 2 plasmid system))购自Addgene(1000000078),由张锋的团队构建(Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 2015)。
全基因激活库(人)为慢病毒载体文库,具有高感染与激活效率。全基因激活库(人)具有70290个sgRNA结构,靶向人类基因组中23430个基因。
Human CRISPR Activation Library(SAM - 2 plasmid system)SpecieshumanNumber of genes targeted23,430Targeting constructs per gene3Total sgRNA constructs70,290Viral plasmid vectorlentiSAMv2
全基因激活库(人)的工作原理
全基因激活库(人)表达的sgRNA的靶位点均在基因转录起始位点上游200bp内,其载体骨架是lentiSAMv2(Addgene,75112)。lentiSAMv2表达具有两个SM2茎环结构的sgRNA和dCas9-VP64。dCas9能够与sgRNA结合,但是没有剪切DNA的活性,VP64是强转录激活域。全基因激活库(人)可以单独使用,而与lenti MS2-P65-HSF1_Hygro(Addgene,61426)联用具有更强的激活表达效果。lenti MS2-P65-HSF1_Hygro表达MS2-P65-HSF1蛋白,MS2结构域能够与SM2茎环结构结合,P65和HSF1是强转录激活域。
全基因激活库(人)和lenti MS2-P65-HSF1_Hygro共转染细胞时,由具有SM2茎环结构的sgRNA、dCas9-VP64和MS2-P65-HSF1组成的复合体结合到基因组DNA中的靶位点上,激活下游基因大量转录。
全基因激活库(人)的使用方法
1、lenti MS2-P65-HSF1_Hygro包装慢病毒。
2、慢病毒粒感染目标细胞,Hyg筛选得到稳定细胞株。
3、全基因激活库(人)包装慢病毒,感染表达MS2-P65-HSF1的稳定细胞株。
4、用BSD筛选出阳性细胞。
5、药物筛选或者辐射处理等,对照组不处理或者虚假处理。
6、提取基因组DNA,PCR扩增sgRNA的编码序列。
7、sgRNA的编码序列高通量测序。
8、比较对照组和实验组的高通量测序结果,筛选感兴趣的基因。
9、单独验证筛选出来的基因。
使用CRISPR/Cas9全基因激活库的文献
1、Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature, 2015
2、 Compact and highly active next-generation libraries for CRISPR-mediated gene repression and activation . Elife, 2016
2、Genome-scale CRISPR-Cas9 Knockout and Transcriptional Activation Screening. Nature Protocols, 2017
4、Genome-scale activation screen identifies a lncRNA locus regulating a gene neighbourhood. Nature, 2017
全基因激活库(人)出货说明
1、全基因激活库(人)20μg,浓度500ng/μL以上,超螺旋率95%以上。
2、全基因激活库(人)说明书一份。
3、随时出货。
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