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实验技术服务-体外转录与逆转录
体外转录概述 体外转录是指在含有RNA转录酶、必要的蛋白质因子、核苷三磷酸等条件的体外无细胞系统中,,模仿体内转录过程以DNA为模板转录生成RNA的技术。 实验流程 (1)制备DNA模板:PCR片段和质粒DNA都可以用作体外转录的模板,但必须使用线性化的DNA,且保证DNA模板中没有RNase,在用作模板前采取胶回收的方法回收质粒DNA以纯化DNA模板。(2)体外转录:加入反应体系 → 60℃水浴去除模板中的RNase → 冷却后加入T7 RNA 聚合酶,37℃保温2h → 70℃加热10min灭活T7 RNA聚合酶 → 电泳检测转录效果(3)去除DNA模板: 用等体积的含有RNase-free DNase的Tris饱和酚-氯仿抽提,加入0.1 倍体积的3M NaAc和2倍体积的乙醇,高速离心去上清,加入75%的乙醇振荡,高速离心去上清,用DEPC水溶解RNA。 结果展示 逆转录概述 逆转录是以RNA为模板合成DNA的过程,即RNA指导下的DNA合成。逆转录需逆转录酶的催化。人们通过体外模拟该过程,以样本中提取的mRNA为模板,在逆转录酶的作用下,合成出互补的cDNA,构建cDNA文库,并从中筛选特异的目的基因。该方法已成为基因工程技术中最常用的获得目的基因的策略之一。 实验流程 (1)TRlzol法提取RNA(2)RT-PCR反应(3)RNase H酶处理(4)PCR扩增成稳定的双链DNA 实验结果
体外转录,体外转录与逆转录
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