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参考报价: | 面议 | 型号: | 体外转录与逆转录 |
品牌: | 生命互联 | 产地: | 武汉 |
关注度: | 20 | 信息完整度: | |
样本: | 典型用户: | 暂无 |
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实验技术服务-体外转录与逆转录
体外转录
概述
体外转录是指在含有RNA转录酶、必要的蛋白质因子、核苷三磷酸等条件的体外无细胞系统中,,模仿体内转录过程以DNA为模板转录生成RNA的技术。
实验流程
(1)制备DNA模板:PCR片段和质粒DNA都可以用作体外转录的模板,但必须使用线性化的DNA,且保证DNA模板中没有RNase,在用作模板前采取胶回收的方法回收质粒DNA以纯化DNA模板。
(2)体外转录:加入反应体系 → 60℃水浴去除模板中的RNase → 冷却后加入T7 RNA 聚合酶,37℃保温2h → 70℃加热10min灭活T7 RNA聚合酶 → 电泳检测转录效果
(3)去除DNA模板: 用等体积的含有RNase-free DNase的Tris饱和酚-氯仿抽提,加入0.1 倍体积的3M NaAc和2倍体积的乙醇,高速离心去上清,加入75%的乙醇振荡,高速离心去上清,用DEPC水溶解RNA。
结果展示
逆转录
概述
逆转录是以RNA为模板合成DNA的过程,即RNA指导下的DNA合成。逆转录需逆转录酶的催化。人们通过体外模拟该过程,以样本中提取的mRNA为模板,在逆转录酶的作用下,合成出互补的cDNA,构建cDNA文库,并从中筛选特异的目的基因。该方法已成为基因工程技术中最常用的获得目的基因的策略之一。
实验流程
(1)TRlzol法提取RNA
(2)RT-PCR反应
(3)RNase H酶处理
(4)PCR扩增成稳定的双链DNA
实验结果
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注:该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案,不可用于临床诊断或治疗等相关用途