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这是目前用于顺序分析的最主要的方法。它的原理是从N端开始,逐步降解。将肽先与PTH试剂在pH8-9条件下作用,肽的NH2末端接到异硫qin酸苯酯的C原子上生成苯异硫X甲氨酰肽,简称PTC肽,在强酸作用下,可使靠近PTC基的氨基酸环化,肽键断裂形成苯氨基噻唑啉酮衍生物和一个失去末端氨基酸的肽链。此肽不被破坏,因而又可出现一个新的N-末端。重复以上的步骤,继续与PTH试剂作用,继续分析,苯氨基噻唑啉酮衍生物很容易由有机溶剂抽提出来进行鉴定。但此衍生物很不稳定,在水中可转化为稳定的乙内酰苯硫X脲氨基酸(PTH-氨基酸)。这些步骤通常称为Edman氏逐步降解法。所以可用来测定氨基酸的排列顺序。Edman降解法的优点是样品用量少,灵敏度高。
在蛋白质测序前,蛋白样品首先经过SDS-PAGE的分离,保证样品的纯度满足测序的要求;随后将SDS-PAGE上的蛋白样品转移到PVDF膜上;经过染色确定把蛋白条带并切出;使用Edman测序仪对得到的PVDF膜上的蛋白样品进行分析。Edman降解测序是通过循环反应从蛋白质的N端开始逐个鉴定氨基酸的种类,从而对蛋白质的N端序列进行测定。每一个Edman测序反应包括3步:第一步是在碱性条件下,PITC与蛋白N端的游离氨基结合;第二步是在酸性溶液中,N端残基被切除;第三步是PITC结合的残基转化成为更为稳定的PTH残基,经过在线的HPLC分析,根据洗脱时间确定氨基酸种类。
蛋白N端测序,要求纯蛋白或者接近于纯蛋白,可通过SDS-page胶考染判定;纯蛋白样本可提供粉末。如果蛋白是复合物,可以通过跑SDS-PAGE胶分离蛋白,再PVDF转膜,考染染膜。提供PVDF膜进行测序,将通过剪切特异的PVDF膜染色条带进行测序。氨基酸测定要求5个氨基酸起,可以测定N端的60-70个氨基酸。
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