蛋白质N端测序-Edman降解法

    这是目前用于顺序分析的最主要的方法。它的原理是从N端开始，逐步降解。将肽先与PTH试剂在pH8-9条件下作用，肽的NH2末端接到异硫qin酸苯酯的C原子上生成苯异硫X甲氨酰肽，简称PTC肽，在强酸作用下，可使靠近PTC基的氨基酸环化，肽键断裂形成苯氨基噻唑啉酮衍生物和一个失去末端氨基酸的肽链。此肽不被破坏，因而又可出现一个新的N-末端。重复以上的步骤，继续与PTH试剂作用，继续分析，苯氨基噻唑啉酮衍生物很容易由有机溶剂抽提出来进行鉴定。但此衍生物很不稳定，在水中可转化为稳定的乙内酰苯硫X脲氨基酸（PTH-氨基酸）。这些步骤通常称为Edman氏逐步降解法。所以可用来测定氨基酸的排列顺序。Edman降解法的优点是样品用量少，灵敏度高。

    在蛋白质测序前，蛋白样品首先经过SDS-PAGE的分离，保证样品的纯度满足测序的要求；随后将SDS-PAGE上的蛋白样品转移到PVDF膜上；经过染色确定把蛋白条带并切出；使用Edman测序仪对得到的PVDF膜上的蛋白样品进行分析。Edman降解测序是通过循环反应从蛋白质的N端开始逐个鉴定氨基酸的种类，从而对蛋白质的N端序列进行测定。每一个Edman测序反应包括3步：第一步是在碱性条件下，PITC与蛋白N端的游离氨基结合；第二步是在酸性溶液中，N端残基被切除；第三步是PITC结合的残基转化成为更为稳定的PTH残基，经过在线的HPLC分析，根据洗脱时间确定氨基酸种类。

    蛋白N端测序，要求纯蛋白或者接近于纯蛋白，可通过SDS-page胶考染判定；纯蛋白样本可提供粉末。如果蛋白是复合物，可以通过跑SDS-PAGE胶分离蛋白，再PVDF转膜，考染染膜。提供PVDF膜进行测序，将通过剪切特异的PVDF膜染色条带进行测序。氨基酸测定要求5个氨基酸起，可以测定N端的60-70个氨基酸。

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