单细胞可视化分选培养系统—isoCell

英国iotaSciences公司推出的一款高通量、高自动化的单细胞可视化分选、培养系统。采用微射流技术，利用界面张力对细胞培养基（或干细胞涂层）进行重塑，在培养皿上雕刻出单独的细胞腔室（可以在6厘米培养皿上创建256个单细胞腔室阵列），并将细胞自动地分配到各个单细胞腔室中。

相比于传统方法的低效与高消耗，该系统仅需很少量的培养基与试剂，自动将细胞分选至腔室，通过自带的光学显微镜可以清楚看到腔室中的细胞，以确保分选出的细胞100%为单细胞。系统可将单细胞在GRID中培养成单克隆细胞系，培养过程中可以根据客户需求进行换液操作，全流程可视化监控以确保每个单细胞克隆均来自所挑选的单个细胞，培养完成后可自动收获单克隆细胞系。

通过isoCell单细胞可视化分选培养系统可以实现高通量、自动化、高效率的细胞系构建、CRISPR-Cas9基因编辑等功能。

设备特点

• 自动化的单细胞分选，培养至细胞克隆并收获

• 自动化的单细胞识别及全腔室图像记录

• 操作条件温和，有效维持细胞活性，确保细胞克隆高存活率

• 全触屏控制，系统引导完成整个工作流程

• 自动转移至PCR管或96孔板

• 自动生成每个细胞克隆的克隆性报告

• 兼容多种试剂

主要应用

细胞系构建

单细胞克隆是开发稳定细胞系的关键步骤，这一过程需要进行详尽的记录和验证，以确保最终细胞系的身份、稳定性及一致性。通过质粒转染宿主细胞，建立转染细胞池后，分离单细胞并将其培养成克隆群体至关重要。isoCell的特有的单细胞培养腔室便于进行可靠的单克隆性验证，包括全腔室图像及相关记录。所有繁琐的移液操作均自动化进行，简化了流程并确保了过程的一致性。建立的单克隆细胞系将经过后续多种测试，评估其生长特性和目标产物的生产能力。

CRISPR-Cas9基因编辑

在建立基因编辑细胞的过程中，单细胞克隆是整个工作流程中最大的挑战。CRISPR-Cas9编辑细胞池建立后，分离单细胞并将其培养成克隆群体至关重要。初始细胞池中同时包含编辑和非编辑细胞，因此分离步骤必不可少。传统的手动单细胞克隆方法繁琐且难以确保单克隆性，isoCell的单细胞培养腔室能够轻松可靠地验证单克隆性，解决了上述问题，同时将所有移液操作自动化，简化了流程并确保了一致性。

应用案例

人诱导多能干细胞（hiPSCs）敲除/单核苷酸多态性（SNP）敲入的优化CRISPR实验方案

本文提出了一种优化CRISPR-Cas9方案，用于在人类诱导多能干细胞（hiPSCs）中高效实现基因敲除（KO）或单核苷酸多态性（SNP）敲入（KI）。该流程整合了基因组靶向设计、CRISPR递送、编辑效率评估和自动化单细胞克隆分离技术，显著提高了基因编辑的成功率和克隆存活率。研究人员采用isoCell自动化平台进行单细胞克隆分离，显著提升了克隆筛选的效率和准确性。

完成转染的hiPSCs经过编辑效率验证后，使用isoCell进行单细胞克隆分选。以下步骤描述的是针对一个细胞克隆GRID（包含256个独立腔室）的接种过程，预期细胞克隆存活率不低于40%。

采用isoCell优化的细胞克隆方法，在256个腔室的GRID中，接种当天可计数到平均70个含有单细胞的小室（图A），其中平均有46个克隆存活，存活率可达65%。对于22种不同的iPSC细胞系的32个基因位点的KO score和KI score评分，最低的评分分别为15和10（图B）。但由于相对较高的克隆效率，一块GRID也能够获得多达5个克隆。

参考文献：

Ludwik, K. A., Telugu, N., Schommer, S., Stachelscheid, H., & Diecke, S. (2023). ASSURED-optimized CRISPR protocol for knockout/SNP knockin in hiPSCs. STAR protocols, 4(3), 102406.

《Cell》胶质母细胞瘤（GBM）通过表观遗传免疫编辑获得骨髓相关转录程序以引发免疫逃逸

胶质母细胞瘤（GBM）在基因组、转录组和表观遗传层面上表现出高度的肿瘤内和肿瘤间异质性。GBM与肿瘤免疫微环境之间的相互作用在肿瘤的发生和发展中起着重要作用。然而，GBM如何促进肿瘤免疫微环境的机制仍然不清楚。英国爱丁堡大学再生医学中心的Steven M. Pollard团队[1]通过体外试验和动物模型发现，胶质母细胞瘤干细胞（glioblastoma stem cell, GSC）通过表观遗传途径进行免疫编辑，促进髓系细胞的招募，形成富含髓系细胞的肿瘤微环境，从而实现免疫逃逸并促进肿瘤进展。

本文中研究者使用iotaSciences的单细胞可视化分选培养系统isoCell分选并培养了NPE-IE Irf8敲除细胞，随后构建了相应的细胞系。NPE-IE Irf8敲除细胞系的肿瘤发展动力学与移植了NPE-IE细胞的小鼠相似，证明Irf8的激活是NPE-IE细胞免疫逃逸的重要因素，并且这种激活可能通过体内的IFNγ信号介导。

这项研究揭示了GBM细胞在受到免疫攻击后，通过表观遗传重组和髓系特异性转录因子的表达，增强TME的免疫抑制性，促进肿瘤细胞的免疫逃逸。这为监测免疫治疗过程中GBM细胞的免疫逃逸及制定新的免疫治疗策略提供了新的思路，对于在GBM中发现的表观遗传免疫编辑过程是否也适用于其他脑瘤或癌症，将具有重要意义。

参考文献：

[1]. Gangoso,   E., Southgate, B., Bradley, L., Rus, S., Galvez-Cancino, F., McGivern, N.,   ... & Pollard, S. M. (2021). Glioblastomas acquire myeloid-affiliated   transcriptional programs via epigenetic immunoediting to elicit immune   evasion. Cell, 184(9), 2454-2470.

测试数据

人类诱导多能干细胞(hiPSCs)的单细胞克隆

   人类诱导多能干细胞(hiPSCs)构建单克隆细胞系培养步骤繁琐，细胞对异常的处理和操作非常敏感，传统单细胞分选容易导致细胞和遗传毒性应激的积累，进而导致不良分化和多能性丧失。使用isoCell可以温和且自动化地将人类诱导多能干细胞(hiPSCs)进行单细胞分选，并高效地培养hiPSCs单克隆细胞系，显著提高了细胞分离与克隆效率（如下图所示）。

HEK293单克隆细胞培养

对人类诱导多能干细胞 (hiPSCs) Prime 编辑构建工程细胞系

   Prime 编辑可在 HEK3 基因座中高效精确插入三个核苷酸，用于构建工程细胞系hiPSCs。通过引入靶标特异性 pegRNA 来编辑单个或多个基因组位点，以进行精确有效的基因组编辑，促进疾病建模和功能遗传学研究。

   Prime 编辑使用与逆转录酶融合的 Cas9 切口酶，将 DNA 序列从“Prime 编辑”引导 RNA (pegRNA) 复制到特定基因座。通过Prime 编辑将多西环素诱导型 Prime Editor 蛋白 (PE2) 整合到 iPSC 细胞系的AAVS1 基因组，之后使用isoCell分选转入靶基因的hiPSCs细胞系，以确保细胞的单克隆性。（见上图）

该研究使用isoCell来确保工程细胞系的单克隆性与准确性。 

参考文献：

Bharucha N, Ataam J A, Gavidia A A, et al. Generation of AAVS1 integrated doxycycline-inducible CRISPR-Prime Editor human induced pluripotent stem cell line[J]. Stem Cell Research, 2021, 57: 102610.

发表文章

1. Fahy, K., Kapishnikov, S., Donnellan, M., McEnroe, T., O'Reilly, F., Fyans, W., & Sheridan, P. (2024). Laboratory based correlative cryo-soft X-ray tomography and cryo-fluorescence microscopy. Correlative Light and Electron Microscopy V, 293.

2. Fahy, K., Weinhardt, V., Vihinen-Ranta, M., Fletcher, N., Skoko, D., Pereiro, E., ... & McEnroe, T. (2021). Compact Cell Imaging Device (CoCID) provides insights into the cellular origins of viral infections. JPhys Photonics, 3(3).

3. Kapishnikov, S., Hempelmann, E., Elbaum, M., Als‐Nielsen, J., & Leiserowitz, L. (2021). Malaria pigment crystals: The achilles′ heel of the malaria parasite. ChemMedChem, 16(10), 1515-1532.

4. Kapishnikov, S., Staalsø, T., Yang, Y., Lee, J., Perez-Berna, A. J., Pereiro, E., ... & Als-Nielsen, J. (2019). Mode of action of quinoline antimalarial drugs in red blood cells infected by Plasmodium falciparum revealed in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences, 116(46), 22946-22952.

5. Kapishnikov, S., Leiserowitz, L., Yang, Y., Cloetens, P., Pereiro, E., Awamu Ndonglack, F., ... & Als-Nielsen, J. (2017). Biochemistry of malaria parasite infected red blood cells by X-ray microscopy. Scientific reports, 7(1), 802.

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