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双抗体ELISA夹心法(Sandwich ELISA)的原理是将特异性抗体(捕获抗体)结合到固相载体上形成固相抗体,然后加入待检样品,捕获抗体与待检样品的的抗原结合形成免疫复合物,洗涤后再加酶标记抗体(检测抗体),与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物,加底物显色后,即可判断抗原含量,具有高灵敏度、高专一性,抗原无须事先纯化的优点。但捕获抗体与检测抗体必须精心选取,才可避免交叉反应或竞争相同的抗原结合部位。单克隆抗体对定制服务流程(该流程为一般流程,如客户有特殊需求,可协商具体解决方案): 阶段一:抗原制备公司准备抗原,若客户提供抗原,需10-15mg高纯度蛋白质; 阶段二:单抗制备(1-140天)0-60天: 持续免疫5只 Balb/c小鼠,间接ELISA测定血清效价,至效价足够高;60-65天:融合小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞,获得需要的杂交瘤细胞。65-90天:间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞并做亚克隆,提供10株阳性细胞上清给客户,供客户筛选,所有阳性克隆可保存2周左右。90-120天:对客户选出的阳性杂交瘤细胞做第二次亚克隆,保证细胞株的纯度和稳定性,如有必要可增加亚克隆次数。对筛选出的阳性杂交瘤的单克隆抗体进行亚型鉴定,扩大培养客户确认的阳性克隆细胞。120-140天:将扩大培养的阳性杂交瘤细胞制备腹水,并纯化抗体1-2mg。 阶段三:单抗配对(140-180天)140-150天:对纯化抗体做生物素或过氧化物酶(HRP)标记,然后对标记抗体进行分子筛层析纯化。150-180天: 用棋盘式夹心ELISA筛选单克隆抗体对。未标记的抗体做为捕获抗体,标记抗体做为检测抗体,分组配对,做ELISA检测。设置合适的阴性对照,加入标准抗原后OD值明显升高的抗体对,即为配对抗体对。 阶段四:产品交付(180-210天)180-210天:制备以下产品并发货:5mg捕获抗体,1mg标记的检测抗体,2-5株杂交瘤细胞,抗体配对相关数据
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