IP免疫沉淀检测

提供商： 江阴雨汐生物科技有限公司 服务名称： IP免疫沉淀检测 免疫(共)沉淀技术服务 免疫沉淀Co-IP实验技术服务 免疫沉淀反应（Immunoprecipitation）主要用于抗原或者抗体的定性检测。其原理是指可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在的情况下，按适当比例所形成的可见沉淀物现象。据此现象设计的沉淀实验主要包括絮状沉淀试验，环状沉淀试验和凝胶内的沉淀试验。凝胶内的沉淀试验依所用的实验方法又可分为免疫扩散实验和免疫电泳技术2类。 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其基本原理是:细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析。 ※ 免疫沉淀操作流程（以Protein A Agarose方法为例）： 1、蛋白样品的准备 1.1 对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。 1.2 对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。 1.3 对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。 2、去除非特异性结合 2.1 取200微升至1毫升蛋白样品，蛋白量约为200微克至1毫克，加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的Protein A Agarose，4℃缓慢摇动30分钟至2小时。 2.2 2500rpm(约1000g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。 3、免疫沉淀 3.1 加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜。 3.2再加入20微升充分重悬的Protein A Agarose，4℃缓慢摇动1-3个小时。 3.3 2500rpm(约1000g)离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein A Agarose。 3.4 用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤。 3.5 完成zei后一次洗涤后，去除上清，加入20-40微升1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀，瞬时高速离心把样品离心至管底。 3.6 100℃或沸水浴处理3-5分钟，取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳，暂时不用的样品可以-20℃保存。 ※ 免疫共沉淀： 参考免疫沉淀的方法进行，但免疫共沉淀(co-IP)通常必须使用未经冻存的新鲜蛋白样品。普通的免疫沉淀虽然可以使用冻存的蛋白样品，但也宜用新鲜的蛋白样品为佳。 ※ 服务内容： 免疫沉淀是利用抗原蛋白和抗体特异性结合，以及细菌蛋白prorein A/G可特异地结合到抗体的FC片段的原理衍生出来的实验方法。目前多用预先结合了protein A/G的sepharose。免疫沉淀实验用途非常广泛，而且基于zei基本的免疫沉淀实验衍生出了许多免疫沉淀相关实验手段（比如免疫共沉淀、染色质免疫沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀）。因此，免疫沉淀实验的后续检测方法要视实验目的而定。 1. 样品处理； 2. 样品、抗体与Protein A/G sepharose孵育； 3. 抗原、抗体与Protein A/G sepharose复合物洗涤； 4. 沉淀产物鉴定。 ※ 注意事项： 1、细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。 2、使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用 3、使用对照抗体： 单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗 兔多克隆抗体：正常兔IgG 4、在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性，应注意以下几点： 4.1确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生； 4.2 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀； 4.3 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。 ※ 实验过程: 免疫沉淀的实验过程一般分为三个步骤如下: 1.抗原溶液的制备; 2.裂解物非特异性本底的预处理; 3.免疫复合物的形成与纯化. ※ 样品要求： 1. 待检测样品：可以是直接的待检测蛋白样品，也可以是细胞、组织或细菌样品，但需收取蛋白抽提费用； 2. 免疫沉淀用抗体； 3. 检测用抗体。 ※ 终产品： 检测结果及实验报告。

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