4D组学新时代！更快、更深的蛋白组学覆盖

　　离子淌度分离概念的引入使得蛋白质组学进入了4D新时代。4D蛋白质组学是在3D分离即保留时间（retention time）、质荷比（m/z）、离子强度（intensity）这三个维度的基础之上增加了第四个维度--离子淌度（mobility）的分离（图1），进而大幅度的提高扫描速度和检测灵敏度，带来蛋白质组学在鉴定深度、检测周期、定量准确性等性能的全面提升。

　　图1. 新一代4D蛋白质组学示意图

　　基于质谱技术的蛋白质组学研究方法虽然经过25年多的发展，已经取得了长足的进步，并在生命科学研究的各个领域都取得了傲人的成果，但人们对未知世界的探索并没有停滞，蛋白质组学更深度的覆盖就是科研工作者目前要努力的方向之一。但由于蛋白质组学样本的自身复杂性（蛋白丰度的动态范围>106）和目前质谱仪采集速度和灵敏度的局限性，低丰度蛋白鉴定异常困难，这让深度覆盖蛋白组学面临着巨大的挑战。

　　在2010年德国Max Plank生化研究所Matthias Mann和Jurgen Cox团队在《Journal of Proteome Research》上发表文章对这个问题进行了深入讨论（图2），文中提到在当时的仪器条件下，采用DDA采集方法，单针蛋白组学分析可以检测到超过10万个肽段信号，但受制于质谱仪扫描速度和灵敏度，大部分肽段信号无法被选到做MS/MS（被选定的比例小于17%），被选定做过MS/MS的信号，能被鉴定为对应的多肽的更少（低于10%）。因此，Matthias Mann团队一直致力于新方法的开发，以提高“鸟枪法”蛋白质组学覆盖深度。

　　图2. 质谱仪扫描速度对蛋白质组学影响

　　2015年，Matthias Mann团队在布鲁克带有离子淌度的QTOF质谱仪器上开始开发PASEF技术（图3），利用PASEF技术获得的初步数据显示，PASEF技术可以使二级采集速度和灵敏度同时提高3倍以上，接近70%的肽段信号能被选定并获得二级谱图，这个特性可以完美解决传统质谱在采集速度和灵敏度方面的挑战。

　　图3. PASEF技术带来扫描速度和灵敏度同时提升

　　近些年来，伴随着蛋白质组学应用领域的扩展，蛋白质组学又面临着全新的挑战，最突出的几个问题就是微量样本的挑战、大对列样本分析对高通量方法和仪器稳定性的要求以及对翻译后修饰的精确鉴定和定量分析（图4）。

　　图4. 蛋白质组学新挑战

　　面对着这些全新挑战，布鲁克应用专家和Matthias Mann团队采用已经成熟的timsTOF Pro质谱平台，展示了其在蛋白质组学领域应用中的超乎想象的卓越性能，并用真实样本再次诠释了timsTOF Pro超快的二级采集速度（实际使用的平均扫描速度为120Hz）和超高灵敏度为深度蛋白质组学研究带来的便利。2018年11月，Matthias Mann团队在《Molecular & Cellular Proteomics》发表文章（图5），对timsTOF Pro的性能进行了详细的评估，其中有提到了几个非常重要的信息：

• 每秒钟可以采集超过100张二级谱图；

• 单针进样200ng，120min色谱方法可以鉴定超过6000个Protein Group，10ng进样，30min色谱方法可以鉴定超过2500个Protein Groups；

• timsTOF Pro在长期使用中显示出了突出的稳定性（图6）。

  

　　图5. Matthias Mann团队对timsTOF Pro性能评估

　　图6. Matthias Mann团队对timsTOF Pro稳定性评估

　　同时，布鲁克应用专家也对timsTOF Pro的灵敏度进行了专门评估(图7)，采用timsTOF Pro标准质谱采集方法和60min色谱梯度，通过进样不同量的（3.125ng-100 ng）的HeLa样本考察仪器的灵敏度，100ng进样可鉴定到5091个Protein Families，超过45000PSM，3.125ng（相当于从12.5个HeLa细胞提取的蛋白量）进样可鉴定到1654个Protein Families。

　　图7. 布鲁克应用专家对timsTOF Pro灵敏度评估

　　综上所述，布鲁克4D组学平台timsTOF Pro带来的采集速度与灵敏度的同时提升，能很好的应对新时代蛋白质组学面临的挑战。基于timsTOF Pro这些特点开发的高通量和高灵敏度临床蛋白组学方法，也必将在精准医学/个体化医疗方面大有可为。

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　　参考文献：

　　1. Annette Michalski, et al., More than 100,000 Detectable Peptide Species Elute in Single Shotgun Proteomics Runs but the Majority is Inaccessible to Data-Dependent LC-MS/MS. J. Proteome Res. 2011, 10, 1785–1793

　　2．Florian Meier, et al., Parallel Accumulation–Serial Fragmentation (PASEF): Multiplying Sequencing Speed and Sensitivity by Synchronized Scans in a Trapped Ion Mobility Device. J. Proteome Res. 2015, 14,12, 5378-5387

　　3．Florian Meier, et al., Online Parallel Accumulation–Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer. Molecular & Cellular Proteomics, 2018,17(12),2534-2545.

　　4．Romano Hebeler, et al.,PASEF for sensitive shotgun proteomics: toward single cell analysis. ASMS 2018, WP 446