Lyo-ready Bst DNA聚合酶冻干和风干后的稳定性评估，文末申请试用

2023-08-23 13:33:25, 赛默飞生命科学赛默飞世尔科技生命科学产品

前言

将分子诊断试剂制成冻干制剂可增强产品在室温下的稳定性，延长产品的效期，已成为分子诊断试剂开发的方向之一。常规的酶原料中含有50%的甘油作为冷冻保护剂，因此不适合干燥处理。Invitrogen™ Lyo-ready Bst DNA 聚合酶（货号：A56655/A56656/A56657）是野生型Bst DNA聚合酶大片段的独有突变体，具有更快的反应速度、增强的灵敏度及抑制剂耐受性。其具有强链置换活性，可用于高效的环介导等温扩增（LAMP）。其既可满足基于LAMP技术诊断试剂的高性能要求，同时也可兼容干燥处理，适合用于开发快速灵敏的干式LAMP诊断试剂。

将生物材料进行干燥处理，最常用的技术是冷冻干燥，其为将不同生物材料进行干燥处理的金标准。但冷冻干燥也有不足之处，如需要昂贵的冻干设备、冻干时间较长等。近期风干处理逐渐流行，此方法使用简单的烘箱使水分蒸发，无需昂贵的配套设备，干燥过程也更加快速。但风干处理主要担心的是当把酶长时间暴露于热环境中，酶的稳定性会受到影响。

图1. 冻干和风干示意图。（A）冻干过程——首先将产品冷冻于溶液中，然后放置于真空环境，通过升华去除冰。（B）风干过程——使用简单的烘箱使水分蒸发。

在此我们评估了Lyo-ready Bst DNA聚合酶冻干制剂和风干制剂的稳定性，以及它们检测SARS-CoV-2 RNA的能力。

材料与方法

酶制备

风干处理：
- 将Lyo-ready Bst DNA聚合酶按10 µL分装到Eppendorf™ 1.5 mL反应管中，在烘箱（Binder BD53）中50℃风干2.5小时。
- 风干后的样本放置于塑料袋中（含干燥剂），在25℃下存放13周。
- 每个风干的酶样本使用无核酸酶水重新溶解至10 µL终体积。

冻干处理：
- 将Lyo-ready Bst DNA聚合酶按10 µL分装到Applied Biosystems™ MicroAmp™ Fast Optical 96孔反应板（货号：4346907）中，使用SP VirTis™ Advantage Pro™ XL Freeze Dryer (SP Industries)按照表1的参数进行冻干。
- 冻干后的样本放置于塑料袋中（含干燥剂），在25℃下存放13周。
- 每个冻干的酶样本使用无核酸酶水重新溶解至10 µL终体积。

表1. 冻干参数设置

聚合酶活性检测

通过在60℃下30分钟将10 nmol脱氧核糖核苷酸掺入到多聚核苷酸片段来测量聚合酶活性。

RT-LAMP功能测试

用于检测SARS-CoV-2 RNA的RT-LAMP反应混合液与冰上配制于MicroAmp™ Fast Optical 96孔反应板中，单个RT-LAMP反应的终体积为25 µL。
使用无菌过滤枪头避免气溶胶污染。表2为SARS-CoV-2 RNA检测的反应体系配制方案。
病毒RNA检测的RT-LAMP反应在Applied Biosystems™ QuantStudio™ 7 Flex实时定量PCR系统上进行。
按照表3中的参数设置一步循环条件。
使用Applied Biosystems™ QuantStudio™ 实时定量PCR软件分析反应动力学和扩增产物的特异性。
通过溶解曲线分析确定RT-LAMP反应的特异性。

表2. SARS-CoV-2 RNA检测反应体系配制

表3. RT-LAMP一步循环方案

结果与讨论

为了评估Lyo-ready Bst DNA聚合酶的稳定性，将风干和冻干的样本在25℃下放置13周。在不同的时间点检测聚合酶的活性。一般来说，风干和冻干的酶相比常规酶会损失20-30%的活性。如图2所示，不管是风干还是冻干的样本，在长时间存放过程中，均能保持稳定，聚合酶活性仅有轻微变化。图中计算出了干燥和非干燥样本的聚合酶活性比例，表明酶的活性在干燥处理和长时间存放后没有明显的损失。

图2. 在25℃长时间存放后，风干和冻干Lyo-ready Bst DNA聚合酶的稳定性。将风干和冻干的Lyo-ready Bst DNA聚合酶样本在25℃存放13周，在不同的时间点测量聚合酶的活性。每此测量进行3个重复，并计算出标准偏差。

为了进一步评估酶的性能表现，使用在25℃存放13周的风干和冻干Lyo-ready Bst DNA聚合酶样本进行RT-LAMP反应。图3结果表明，不管是风干还是冻干的Lyo-ready Bst DNA聚合酶，均成功检测出了SARS-CoV-2 RNA。扩增曲线在扩增开始~5分钟出现，阴性对照在14分钟后才出现，表明干燥处理未影响酶的灵敏度和特异性。

图3. 使用风干和冻干的Lyo-ready Bst DNA聚合酶检测SARS-CoV-2 RNA。将风干和冻干的Lyo-ready Bst DNA聚合酶样本在25℃存放13周，在不同的时间点测量聚合酶的活性。每此测量进行3个重复，并计算出标准偏差。使用（A）风干和（B）冻干的Lyo-ready Bst DNA聚合酶针对1000拷贝SARS-CoV-2 RNA进行RT-LAMP扩增。比较干燥处理前后的扩增情况。结果显示，在25℃长时间存放后，不管使用哪种干燥处理方式，酶的扩增速度、灵敏度和特异性均没有损失。

结论

Lyo-ready Bst DNA聚合酶在风干和冻干处理后表现出高稳定性。干燥处理后酶的活性保持稳定，相比干燥处理前，酶的活性变化保持在正常范围内。RT-LAMP反应保持了SARS-CoV-2 RNA检测的速度和灵敏度。由于Lyo-ready Bst DNA聚合酶可兼容不同的干燥方式，使其成为即时检测和现场检测的理想选择，为分子诊断试剂的开发提供了可靠和经济的解决方案。