荧光定量小课堂——实时荧光定量 PCR 荧光检测系统

这几天，有不少人被网易云音乐贴在地铁里的5000条优质评论扎到心坎里了。

看了这些评论，有人想起了曾经的理想和爱情，有人开始思念远方的朋友和亲人。不得不说，这个情怀“贴”得真的很到位！

其实，小编想起大家为了搞科研、做生产，没日没夜忙成狗的样子，也不禁会动容。我们实验党，也是讲情怀的呀！但是，宣扬过情怀之后，还是得投入到紧张充实的工作中。

好了，同志们坐稳了，这辆贴满“实时荧光定量 PCR 荧光检测系统”知识点的列车，现在发动啦~

实时荧光定量 PCR 试剂的种类很多，但最常用的是 5’ 核酸酶 Assay，例如 TaqMan™Assay 和基于 SYBR™ Green 染料的 Assay (图 1)。

图1. 5’ 核酸酶 Assay。

5’ 核酸酶 Assay 以 Taq DNA 聚合酶的 5’ 核酸酶活性命名(图 2)。

图 2. Taq DNA 聚合酶图示。 每个不同颜色的球表示一个蛋白质结构域。

5’ 核酸酶结构域能够在 DNA 合成结束后，降解与模板结合的 DNA。5’ 核酸酶 Assay 的第二个关键元件是一种称为FRET 的现象：荧光共振能量转移 (fluorescent resonance energy transfer，FRET)。在 FRET 中，邻位的另一种染料——通常被称为淬灭剂——可大大降低荧光染料的发射信号 。

可通过两种荧光染料对 FRET 进行图示说明：绿色和红色 (图 3)。绿色荧光染料的发射光能量较红色荧光染料更高，这是由于绿光的波长比红光短。如果红色染料邻近绿色染料，则激发绿色染料将导致绿光的发射能量被转移至红色染料上。换言之，能量从高处转移至低处。继而绿色染料的信号将被抑制或“淬灭”。但如果两种染料相距较远，则不会出现 FRET 现象，绿色染料能发射出全部信号。

图 3. FRET 现象举例。 (A) 当绿色荧光染料与红色荧光染料靠近时可出现FRET。(B) 当两种荧光染料相距较远时，不会出现 FRET。

用于靶点检测或定量的 5’ 核酸酶 Assay 通常包括两个PCR 引物和一个 TaqMan™ 探针 (图 4)。

图4. TaqMan™ 探针。TaqMan™ 探针具有基因特异性序列，可与两个 PCR 引物之间的靶点结合。TaqMan™探针的 5’ 端带有“报告基团”，该荧光染料将报告靶点的扩增。探针的 3’ 端为淬灭剂，它可以淬灭完整探针中报告基团发出的荧光。淬灭剂还将阻断探针的 3’ 端，这样即无法在热稳定性 DNA 聚合酶作用下延伸。

在 PCR 开始之前，TaqMan™ 探针完整且具有一定的灵活性。探针完整时，报告基团和淬灭剂之间具有天然的亲和力，可促进 FRET 的发生 (图5)。在 PCR 开始之前，报告基团信号被淬灭。

图5. TaqMan™探针图示。R 为报告基团染料，Q 为淬灭剂分子，橙色的线条表示核苷酸。

在 PCR 过程中，引物和探针与靶点退火结合。DNA 聚合酶延伸探针上游的引物。如果探针与正确的靶序列结合，则聚合酶的 5’ 核酸酶活性会切断探针，释放出含有报告基团染料的片段。剪切完成后，报告基团和淬灭染料不再相互吸引；释放的报告基团分子将不再被淬灭。

Assay 特异性是指 Assay 结果中包括靶点信号且排除非靶点信号的程度。特异性可以说是任何一个 Assay 中最重要的方面。影响 5’ 核酸酶 Assay 特异性的最重要因素是同源物。同源物是与靶点序列相似的基因，但不是 Assay 的目的靶点。同源物在种属内部及相关种属之间极为常见。

5’ 核酸酶 Assay 提供了两种特异性工具：引物和探针。靶点与同源物之间的错配发生在引物的 3’ 最末端的碱基对引物的特异性影响最大，而远离 3’ 末端的错配对特异性影响较小。而发生在 TaqMan™ MGB 探针 (较 TaqMan™ TAMRA™ 探针短) 大部分位置上的错配对特异性的影响极大——TaqMan™ MGB 探针是比引物更有效的实现特异性工具。

例如，引物结合位点上的一个或两个碱基的随机错配将极有可能使 DNA 聚合酶高效延伸与同源物结合的引物。DNA 聚合酶作用下的一个或两个碱基的延伸将稳定与同源物结合的引物，因此其结合的稳定性同引物与完全互补的目的靶点的结合相当。此时，DNA 聚合酶将继续合成，生成同源物的拷贝。

在 TaqMan™ 探针 3’ 端的淬灭剂的作用下，DNA 聚合酶无法稳定 5’ 端的错配。TaqMan™ MGB 探针结合位点上的错配将降低探针结合的紧密度，这样探针不会被剪切，而是整个探针被置换。整个探针回到其淬灭结构，当 PCR 循环结束采集数据时，信号由靶点而非同源物产生，即便同源物亦扩增，也不会产生信号。

除同源物外，PCR 还可扩增非特异性产物，这是引物与样本 DNA 的随机位点结合或者引物自身结合 (称为“引物二聚体”) 产生的。由于非特异性产物与靶点无关，因此它们无 TaqMan™ 探针结合位点，在实时荧光定量 PCR 数据中不可见。

TaqMan™ 探针可分为两种类型：MGB 和非 MGB。第一款TaqMan™ 探针属于“非 MGB”。它们采用 TAMRA™ 染料作为淬灭剂。在实时荧光定量 PCR 发展的早期，大量测试显示，TaqMan™  探针所需的退火温度远高于 PCR 引物的温度，因而无法完成剪切。因此，TaqMan™  探针的长度要大于引物。这种长探针上出现一个碱基错配对探针结合的影响相对较小，可完成剪切。但对于很多遗传复杂性较高的应用领域，如真核基因表达和单核苷酸多态(Singlenubleotide polymorphisms，SNP)，则需要更高的特异性。

TaqMan™ MGB 探针是在 TaqMan™ 探针技术基础上进一步改良而成的。TaqMan™MGB 探针的 3’ 端带有小沟结合物(MGB) 分子。探针与靶点结合后，DNA 内形成较短的小沟，使  MGB 分子结合，提高了熔解温度；从而增强了探针的结合。TaqMan™  MGB 探针的长度可以大大短于 PCR引物。由于 MGB 基团的存在，这些探针可以较 TaqMan™探针更短，同时能够达到较高的熔解温度。与引物相比，TaqMan™  MGB 探针能在更高的温度下，与靶点更特异性地结合。TaqMan™ MGB 探针更短，一个碱基的错配对其结合的影响更大。由于 TaqMan™ MGB 探针具有更高的特异性，因此其被推荐用于大多数遗传复杂性高的应用领域。

无论您选择 MGB 还是非 MGB 探针，其信号图谱均相同。在早期 PCR 循环中，只能检测到较低的淬灭报告基团信号。在实时荧光定量 PCR 软件中，这些早期数据被自动消减为零，称为“基线”。如果样本含有靶点，则最后将生成足够量的剪切探针，使扩增信号高于基线。扩增信号变得可见的时间点与初始靶点量呈反比。

SYBR™ Green I 染料是一种荧光 DNA 结合染料，可与双链 DNA 的小沟结合。激发与 DNA 结合的 SYBR™ Green染料可产生较未结合染料更强的荧光信号。基于 SYBR™Green 染料的 Assay 一般包括两个 PCR 引物。在理想状态下，SYBR™Green Assay 的扩增图谱与基于 TaqMan™探针的 Assay 类似。在早期 PCR 循环中，可观察到水平基线。如果样本中存在靶点，则在某个时间点将生成足够的 PCR 产物，使扩增信号变得可见。

Assay 特异性测试对所有 Assay 都十分重要，尤其是那些容易遇到特异性问题的 Assay。SYBR™ Green Assay不具有 TaqMan™探针的特异性，因此更容易出现特异性问题。SYBR™ Green 染料将与扩增产物、靶点或非靶点结合，所有这些信号经过汇总后可生成一条扩增曲线。SYBR™ Green 扩增曲线的形状无法用于特异性评估。不论扩增的是靶点、非靶点还是混合物，曲线外观几乎相同。SYBR™ Green Assay 产生的扩增不应被理解为大部分信号源自靶点。

不同样本之间的非靶点扩增有所差别，每个 SYBR™Green 反应都应完成至少一种类型的特异性评估。最常用的评估是解离分析。

SYBR™ Green 解离是采用 SYBR™Green 完成 PCR 反应后，PCR 产物逐渐熔解。解离是一种极佳的特异性评估方法，它无需额外的实验成本，在 PCR 反应容器内即可进行。但解离延长了热循环实验方案，需要额外的分析时间，同时具有一定的主观性，且分辨率有限。

SYBR™ Green 解离的概念是，如果靶点是一个确定的基因序列，则应具有一个特定的熔解温度 (Tm)，可用于帮助样本中的靶点鉴别。一些非靶点产物的 Tm 值与靶点相差较大，从而实现了非靶点扩增的检测。

在最后的 PCR 循环完成后，增加解离实验方案。完成熔解过程后，实时荧光定量 PCR 软件将绘制数据的一阶导数的负值，使熔解曲线变为单峰。

靶点峰的准确鉴别取决于纯靶点的扩增。很多样本 (如 RNA 和基因组 DNA) 具有较高的遗传复杂度，有利于非靶点的扩增，同时抑制了靶点扩增，在某些情况下甚至改变了熔解峰的形状。研究人员采用纯的靶点作为起始材料，能够在扩增后将 Tm 峰和形状与特定的靶点相关联。应只观察到单峰。假定靶点峰应窄而对称，无不规则形状，如肩、驼峰或分割。这些不规则的形状说明生成了 Tm 值相当的多个产物，使人对反应的特异性产生怀疑。出现不规则解离的孔应从进一步分析中省去。

SYBR™ Green 解离的分辨率较低，且无法区分 Tm 值相当的靶点和非靶点，如同源物。因此窄而对称的单峰不应确定为靶点或者某种产物，需额外的支持信息。

应评估每个可以观察到扩增的孔的解离数据。如果样本中包含的峰无法对应纯的靶点峰，则结论是反应中未检测到靶点。如果样本中包含的峰似乎与 Tm 值及纯靶点峰的形状匹配，则反应中可能有靶点扩增。利用单独的解离曲线无法获得确定的结果，但当其与其它信息相结合 (如阴性靶点样本、序列或凝胶)，则可提高特异性的可信度。