【知识分享】液相和液质系统中的管路和接头

2022-12-26 15:05:15

本文将详细讲解管路(材质)和接头(类型)的选择以及安装操作方法，这不仅利于死体积的控制，还能够有效改善目标物的色谱行为。

管路的材质

分析型液相色谱系统中，泵后输液管路接口的外径一般为1/16英寸(约1.6 mm)，而接头的内径也是如此，仅有个别例外，比如某些阀和流通池。最被广泛应用的管路材料有不锈钢、PEEK(聚醚醚酮)、PTFE(聚四氟乙烯)，以及其他一些特殊情形下使用的材料：钛金属、不锈钢包覆的PEEK、PEEK包覆的熔融石英等。表1中列举了这些材料的主要物化特性。

图1A 不锈钢管路

图1B PEEK管路

表1

HPLC常用材料的特点

材料	pH范围	耐压Mpa	优点	缺点	适用
不锈钢（SS）	1-14	130	耐压高；对弱极性/非极性溶剂耐受性好	不耐受卤素离子；不耐受强酸强碱；存在游离金属离子及离子型吸附位点，会对极少数强解离性目标物(比如蛋白)的色谱行为产生负面影响。	满足绝大多数液相色谱法应用；采用弱极性或非极性流动相的正相色谱法的首选；凝胶渗透色谱法的首选；反相色谱法/反相离子对色谱法的极佳选择，尤其是UHPLC
PEEK	0-14	20	对强酸强碱以及其他强极性溶液耐受性好；不存在针对中强极性以及解离型目标物的活性位点	耐压性较差，在UHPLC中只能用在柱后。对弱极性和非极性溶液耐受性差，如二氯甲烷、四氢呋喃、二甲基亚砜会使其溶胀。	满足绝大多数液相色谱法应用；离子色谱的首选；凝胶过滤色谱法的首选；反相色谱法/反相离子对色谱法的极佳选择，尤其适合强解离型目标物
钛 (Ti)	1-14	60	兼具不锈钢与PEEK材质的优点：对液相色谱法中涉及的溶液均能很好地耐受；对弱极性、中强极性以及解离型化合物均具有极好的惰性	昂贵	不锈钢管线的极佳补充：对金属敏感的蛋白质和生物制剂的分析，通常溶剂条件都非常具有挑战性。另外，生物分子易与表面发生非特异性结合。而钛管线是这些应用的首选。
不锈钢包覆的PEEK (内层PEEK，外层不锈钢)	1-14	60	由于是在PEEK管外壁包覆了不锈钢材料，该管路耐压可达600 Bar。因内衬是PEEK材质，故不含金属，对生物样品以及容易螯合金属离子的小分子样品友好	昂贵	与PEEK材质适用范围等同，但耐压范围极大扩展，从耐压角度看，能覆盖大部分的UHPLC应用。
PEEK 包覆熔融石英	0-10	69	最规则而光滑的内壁，在所有类型管线中能最好地抑制样品扩散，赋予最好的柱效；管路内径最精准；耐受绝大多数有机试剂；金属杂质含量极低，表面化学惰性好，与目标物不存在特异吸附	pH范围窄，不耐受较高pH的流动相；不耐受氢氟酸；昂贵。	追求最高柱效的应用。
PTFE	0-14	10	耐受强酸强碱；几乎不溶于任何有机试剂；表面光滑	耐压低；易变形。	用做液相色谱系统的废液管，如泵的purge管路以及检测器的废液管；用做柱后衍生的反应管路

由于耐压超高，不锈钢材质的管路是液相色谱系统的首选，也是UHPLC柱前管路的不二选择。因不锈钢对非极性、弱极性有机试剂的优良耐受，也是正相色谱法和凝胶渗透色谱法(GPC)的首选。它自身的一个小缺陷就是可被卤素离子（包括Cl^-、Br^-、I^-）腐蚀，当流路中存在不锈钢材质时，应避免添加卤素离子。此外，不锈钢管路表面不可避免地存在金属离子以及腐蚀后暴露的活性位点，会影响极少数解离型目标物的色谱行为，譬如多羧基化合物螯合金属离子后保留减弱导致峰前延、譬如目标物的离子基团在管路活性位点上吸附导致峰拖尾甚至分叉。假如同一条件下测试某解离型化合物，仅有部分液相色谱系统存在峰形异常现象，不锈钢管路值得被怀疑。这个问题并非无解，采用EDTA-Na₂水溶液冲洗系统可有效除去系统中游离的金属离子。而采用5%~20%的硝酸水溶液冲洗系统既可以除去游离金属离子又能钝化管路(形成惰性的铬氧化膜)。这两种方法均能有效解决因不锈钢管路导致的异常峰形。特别指出：能被不锈钢管路影响的解离型化合物只是极少数。

因不存在极性吸附位点而且无金属离子，PEEK管路是离子色谱和凝胶过滤色谱系统(GFC)的最佳选择。而且由于PEEK对中强极性化合物、解离型化合物有优异的惰性，在通用型色谱仪中分析解离型化合物时，它的表现(比如峰形)优于不锈钢管路。然而PEEK管路的耐压较低，仅能确保20 MPa以内的压力不漏液（虽然水作流动相时可以耐受40 MPa）。使用5 μm甚至更粗粒径填料时，PEEK管线可作为通用型色谱仪的良好选择。当更细粒径的填料被使用时，由于色谱柱背压高，PEEK管线仅能在柱后使用。此外，非极性和弱极性溶剂作流动相的正相色谱以及凝胶渗透色谱不建议采用PEEK管线。

柱外效应是影响柱效的重要因素，控制死体积范围内管路的内径和长度可有效抑制柱外效应，而选择内壁规则且平滑的管路则能更好地抑制样品谱带的层流和紊流，让柱效进一步提高，而且背压更低。PEEK包覆熔融石英的管路是所有管路中规则最平滑的，专为追求超高柱效、高分离度的应用设计。

接头以及安装方式

虽然市售的接头种类样式繁多，然而大致可分为如下三类：手拧式聚合物材质接头(2A)、不锈钢接头(2B)等。

△图2A PEEK接头

△图2B 不锈钢接头

LC或LC-MS系统对接头最基本的要求是，在工作压力下能紧密地将管路与接口连接在一起。进一步的要求则是，便于安装和拆卸。图3B是液相系统中接口（如色谱柱接口、双通接口、阀接口以及其他能与管路相连的接口）的截面图，灰色区域为固体材料(通常为不锈钢，个别情形为塑料材质)，浅绿色区域为孔隙，用以容纳接头和管路，容纳管路的区域内径为1/16英寸，长度则因品牌而异。图3A则是套在管路与接头，接头可以是图2中的任意一种，韧环区域的内径为1/16英寸；管路可以是任意材质，管路外径为1/16英寸，管路恰好可以穿过接头并伸出一部分长度。

△图3A 套在管路上的接头

△图3B 液相系统中接口的剖面图

连接的一般方法是，将套有接头的管路插到接口的底部，保证管路的切面紧贴接口底部。然后旋转螺丝，让螺丝和韧环向接口内部靠近，当韧环的外表面与接口中韧环区域的内表面接触，旋转螺丝时的阻力开始变大，适当拧紧螺丝挤压韧环(可借助工具)，一方面挤压会使韧环外表面与接口韧环区域的内表面紧密接触，确保高压流动相下不发生泄露；另一方面韧环的尖端因挤压而缩小，能够紧紧地箍住管路，避免漏液并确保流动相的高压不会把管路从接头中挤出，而始终与接口底部紧贴。由此可以看出，韧环是确保管路不移动、流动相不泄露的关键。

2.1

PEEK接头

一直以来，PEEK接头深受HPLC用户喜爱，这主要是因为它便于安装与拆卸，而且它通常不会将管路抱死。在HPLC系统中，PEEK接头一般只用在色谱柱入口及其后，可用于连接各种材质的管路。图4A-4D是PEEK接头连接的详细操作

△图4A 将内径为1/16英寸的管路穿过PEEK接头中间的孔，伸出长度大约5-10 mm (因为不同品牌产品接口内部用于容纳管路的长度有差异，所以此处伸出长度最好长一些)

△图4B 将套有接头的管路插入接口，并确保管路伸到接口底部，然后将接头推向接口

△图4C 旋转PEEK接头，假如连接的是双通/色谱柱，也可以旋转后者。拧紧接头的过程中左手的其他三根手指夹住管路，使管路紧紧地顶住接口底部，避免产生死体积。假设接口是固定在仪器上的(比如流通池)，那么就可以左手捏住管路使其紧紧顶住接口底部，右手旋转接头。手拧接头至管路无法转动。

△图4D PEEK接头与色谱柱拧紧后的状态

当PEEK接头被使用，无论使用何种材质的管路，接头与管路均不会抱死，拆下接头后，接头能够在管路上滑动，连接不同深度的色谱柱接口时均能确保管路截面与色谱柱间没有空隙。然而PEEK接头耐压能力不强，仅能保证20 MPa以内不漏液，超出这个压力就得视操作者的手劲儿了。超压的现象是，管路被高压流动相从接头的韧环区域挤出，流动相从接头的孔中而非螺纹处渗出。

当PEEK接头与PEEK管路被使用，因二者均易于发生形变，拧紧接头的过程中，接头的韧环区域会因挤压而缩小，继而将韧环尖部套着的管路压细，这种轻微的挤压对于耐受更高的压力是有好处的，拆卸后PEEK接头仍能在管路上滑动。然而多次安装拆卸后，韧环和管路均明显变细(如图4E)，此时接头很可能会抱死在管路上，既不能在管路上滑动也不能旋转。这虽然能稍稍增大PEEK接头的耐压，但管路从接头上伸出的长度就无法改变，无法适用于其他深度的色谱柱接口。此外，管路外径变细后内径也相应变细，更容易堵塞。综合考量下，遇到此种情形，应将管路变形的区域切掉并使用新接头。PEEK接头与不锈钢材质管路配合使用时，则基本不会发生形变，多次使用均能完好无损，然而耐压甚至低于PEEK接头+PEEK管路的组合。

△图4E 多次使用后PEEK管路的形变

2.2

不锈钢接头

不锈钢接头与不锈钢管路配合使用时，可以耐受不低于130 MPa的压强，是液相色谱系统的极佳选择。图5A-5F是不锈钢接头与接口的连接方式。

△图5A 一套不锈钢接头包含螺丝(左)、支撑环(支撑环)、韧环。三者均能允许外径为1/16英寸的管路穿过。

△图5B 不锈钢接头在管路上的摆放顺序。螺丝靠里、支撑环居中、韧环在外。

△图5C 将套有接头的管路插入接口，并确保管路伸到接口底部，然后将接头推向接口。

△图5D 手拧接头，假如连接的是双通/色谱柱，也可以旋转后者。拧紧接头的过程中左手的其他三根手指夹住管路，使管路紧紧地顶住接口底部，避免产生死体积。假设接口是固定在仪器上的（比如阀、柱温箱热交换器），那么就可以左手捏住管路使其紧紧顶住接口底部，右手旋转接头。

△图5E 手拧紧后，金属接头并不能牢固地抱住管路，还需扳手紧固。接头一端使用1/4英寸扳手，接口一端视情况而定，如果接口一端是牢固不动的则可以不用扳手。扳手拧紧的过程中，手指轻压管路，确保管路接触到接口底部。在手拧紧的状态下，用扳手再拧约1/2圈即可（或者使用1.5 – 3 N*M的扭力扳手）。

△图5F 将接头从管路拆下来后可以发现，韧环在支撑环和接口的挤压下已经固定在管路上，而螺丝可以活动，支撑环一般也是可以活动的，假如支撑环紧贴韧环不可活动，那么这次固定力气或许过大了，如上图。红色箭头区域为管路伸出的长度，与接口内部深度有关。韧环固定好以后，下次往接口连接时就不必担心管路伸出长度了，但一定要先手拧紧后再用扳手固定。

不锈钢接头+不锈钢管路的组合因其无与伦比的耐压性非常适合HPLC系统的柱前连接，比如泵-压力传感器-混合器-进样器-柱温箱热交换器之间，而且在这些区域安装好以后基本不需要再次拆装，不锈钢接头的不易操作性可以被忽略。与PEEK接头相比，用这种接头连接色谱柱则显得不太便利。尤其需要注意的是，由于不同厂家的色谱柱接口深度不一样，固定好的接头不能同时满足接口深度不同的两款色谱柱。当伸出的管路太长（如图6A），接头拧紧后，韧环的外表面不能紧贴接口内部，流动相会泄露。如果继续用力拧紧螺丝，韧环会被继续往里挤压，最终达到密封，然而接头就不再适合接口较深的色谱柱了。当伸出的管路长度不够（如图6B），管路与接口底部会形成直径达1/16英寸的空腔，这个空腔会造成色谱峰的展宽，危害柱效。假如坚持使用不锈钢连接色谱柱，最好为每一个品牌的色谱柱准备一根做好接头的管路。