ACEA NovoCyte流式细胞仪应用资料 —— 水环境中的细菌检测(上)

2022-05-19 23:10:25 安捷伦细胞分析事业部（BioTek）

快速检测水环境中的细菌一直是微生物学界的一项挑战，尤其是有复杂菌群的自然水环境，检测其中细菌的活性、尺寸和生理特性非常困难。

传统微生物检测时大多基于微生物培养（例如平板计数）后观察，但在自然水环境中能在琼脂培养基中长出群落形态（即可见密度或可见菌落形成）的细菌不到总菌数的1%，大部分细菌虽然明显存在且具有活性，但不能被培养，它们通常被称为“不可培养活细菌(Viable but non-culturable bacteria，VBNC bateria)”。

流式细胞术灵敏度高，可以不依靠细菌的“培养”而进行检测分析,克服了微生物学研究中的一个主要障碍，使得研究观察“不可培养”菌变得可行。与此同时，通过流式细胞仪的散射光和荧光信号可以获得细菌的大小、数量、核酸含量、细胞活性、分类等丰富的信息。

流式细胞技术以其快速分析、高灵敏度、高精确度、多参数、单细胞水平信息以及易于获得相关的统计数据等优点，成为研究细菌的一个重要分析工具，在工业生物技术、食品药品质量控制、饮用水废水系统监测、土壤和天然水微生物生态研究等多个微生物领域有着丰富的应用。

ACEA NovoCyte流式细胞仪对微小颗粒有极高的检测灵敏度，结合多参数分析能力和便利的液路维护设计，NovoCyte流式细胞仪可便捷地应用于各种微生物检测。

仪器准备 —— 确定噪声及细菌的散射光范围

1) 彻底清洗、消毒NovoCyte流式细胞仪样本管路;

2) 开展日常QC测试，确定仪器性能稳定;

3) 测试空白对照（0.1um过滤的去离子水）、0.2µm、1µm标准微球，确定噪声的散射光和细菌的散射光范围。细菌的典型直径大小为0.5µm-1µm，特别小的细菌甚至可以小到0.2µm，所以细菌的物理信号一般在0.2µm和1µm标准微球之间。但由于细菌的折射率一般小于标准微球，所以细菌的物理信号也可能小于0.2µm标准微球;

4) 反复测试空白对照，直到空白对照中除噪声外的粒子浓度小于实验所要求的灵敏度。瑞士联邦公共卫生办公室发布的饮用水分析指南中规定流式法可检测饮用水中细菌浓度范围为1.0×103 – 2.0 x 105 cells/ml，相应地，空白对照粒子数应小于1 cells/µl。0.1µm滤膜过滤的去离子水用SYBR® Green I染色后测试，P1门内的颗粒计数应小于1 个/µl。

不同水体中细菌总数测定

利用核酸荧光染料（如SYBR® Green I、SYTOX® Green I等）对细菌DNA进行染色后，使用流式细胞仪便可以将这些微小的微生物细胞从背景信号中区分出来，结合NovoCyte流式细胞仪精确的体积法绝对计数方法，可以对细菌总数进行直接定量测定（Berney et al., 2008；SLMB，2012）。

基于核酸染色的流式方法还可将自然水环境中的微生物分为低核酸含量菌（LNA菌，Low nucleic acid content bacteria）和高核酸含量菌（HNA菌，High nucleic acid content bacteria）两大菌群。这种依据核酸含量的分类直接反映了典型的微生物流式检测结果。很多人认为HNA菌是某一菌群中最具有活性的细菌，而LNA是没有活性、死的或处于休眠状态的细菌，他们属于同一来源。

但是对于LNA细菌和HNA细菌是否为不同种类的细菌，还是仅仅处于不同的生理状态；LNA细菌是否有活性等都一直争论不断。此外，有研究者将该方法产生的荧光图谱作为细菌群落指纹图谱，用于反映细菌总数无法反映的细菌群落的变化(Hammes et al., 2012; De Roy et al., 2012)。

本应用资料使用ACEA NovoCyte流式细胞仪对多种水体，包括去离子水（ddH2O）、瓶装水（bottled water）、自来水（tap water）、流动山涧水(mountain)、泉水(1:10 spring)、湖水(1:20 lake、1:40 maojiabu)、湿地水(1:50 wetland)中细菌总数进行了测定，非常精确并直接地对不同水体的细菌含量进行了定量。

结果显示：天然水体中细菌虽然肉眼难以观察到，但数量非常巨大；流动的山涧水中细菌含量相对较小，但也达到206个/µL；静止的天然水中细菌含量则会是十倍甚至百倍于此；经过处理的饮用水则非常干净，市售某品牌饮用瓶装水细菌数量小于1个/µL。

此外，使用ACEA NovoCyte流式细胞仪测定了梯度稀释湖水中的细菌总数。结果显示，细菌计数的稀释线性很好，线性拟合后R2为0.9999，表明NovoCyte体积法绝对计数可以实现对微小颗粒的精确计数。