五谷“霉”机的攻克大法

单位简介

国家粮食局科学研究院 

-- 长期从事粮油污染物检测、预警、评估、质量控制等研究，提供从田间到加工全链条的粮油污染物检测评估和防控整体解决方案。

研究背景 

真菌毒素（Mycotoxins）

-- 由特定霉菌或真菌（Fungi）自然产生的化学物质，温暖潮湿的气候条件下，诸如谷物、坚果、香料、干燥的水果、苹果汁及咖啡等的农作物和食品都有可能"发霉"，从而可能被真菌毒素污染。最常见的真菌毒素有：黄曲霉毒素（Aflatoxins，AFs）、呕吐毒素（Vomitoxin, DON）、赭曲霉毒素（Ochratoxins, OTA）、伏马毒素（Fumonisin, FBS）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone, ZON）和T-2毒素（Trichothecenes）等。真菌毒素对人体和动物健康的急慢性影响已经经过了科学验证。真菌毒素污染是不可避免的风险，因此必须要对粮谷、饲料及其原材料上游产品进行严格检测监管，才能保证食品、畜牧业、粮食贸易及其加工产品行业稳定有序安全的运行。

欧盟已制定了玉米中DON、ZON、AFs、FBs、OTA、T-2和HT-2等真菌毒素的法规限量和推荐限量，我国规定了玉米中DON、ZON、黄曲霉毒素B1（AFB1）、OTA等四种毒素限量。目前，各标准化组织颁布的真菌毒素检测标准方法主要为色谱法、荧光光度法和酶联免疫法，难以满足现代食品安全对痕量有害物质进行确证和多组分同时检测的需求。

液相色谱质谱法（LC-MS）集合了液相色谱高效分离与质谱灵敏度高、选择性好等优势，可以同时进行多组分确证和定量分析，为了降低基质对毒素离子化的影响、提高灵敏度和选择性，去除提取液中色素、蛋白、脂类等基质组分延长色谱柱的寿命，近年来使用MycoSep 226多功能净化柱，多毒素免疫亲和柱净化的方法用于真菌毒素的检测越来越多。不论是使用化学填料的多功能净化柱还是使用生物抗体的免疫亲和净化柱，由于不同种类毒素理化性质差异较大，不可避免造成某些毒素的损失，例如MycoSep 226多功能净化柱吸附FBs、糖苷化DON和OTA等毒素，不能实现所有法规限量毒素同时净化的目的，而六合一的免疫亲和柱主要针对六类11种毒素，价格昂贵、对操作者的要求严格，货架期短，应用推广受到一定的限制。近年来，随着质谱仪和色谱仪硬件的改进，以及亚微米级色谱柱的普及，检测灵敏度逐渐提高。在满足法规限量的前提下，可以将提取液稀释后直接注入LC-MS仪器进行检测，有效避免了净化过程中目标物的损失，减少对特殊材料的依赖，降低检测成本，实现多组分物质的同时检测。

实验详解 

仪器

Thermo Scientific TSQ 系列三重四极杆质谱（配置有H-ESIII源）

液相条件

柱温：40°C；进样量：2 mL；流速：0.3mL/min。

▼ 流动相梯度洗脱条件

质谱条件

离子源：电喷雾离子源。

质谱扫描方式：多重反应监测模式（SRM）。

喷雾电压：3.0 kV（＋），2.5 kV（－）。

加热气温度：100℃。

鞘气流速：40 L/hr。

辅助气流速：20 L/hr。

离子传输毛细管温度：350℃。

碰撞气压力：1.5 mTorr。

▼表1.   16种真菌毒素的质谱条件

实验结果

线性范围及相关系数，见表2所示

▼ 表2. 净溶液内标标曲中16种真菌毒素的线性方程、相关系数及线性范围

16种毒素的玉米基质加标TIC图和提取离子流图，见图1。

▲ 图1.  16种真菌毒素标准品的MRM色谱图

准确度和精密度试验结果

玉米和小麦样品基质中3个添加水平，平行6次测定结果的回收率和相对标准偏差，见表3。

▼表3. 小麦、玉米中16种真菌毒素的加标回收率

结论

本方法实验设备使用少、操作简单、前处理时间短、可对样品进行批量处理、有机溶剂用量少，提取液几乎不会暴露于空气中，对实验人员危害小、绿色环保。在小麦和玉米基质中16种真菌毒素线性良好，结果表明仪器精密度良好；方法检出限和方法定量限能够满足限量要求。