2019-12-06 12:10:42 北京毅新博创生物科技有限公司
电喷雾质谱技术 (electrospray ionization ,ESI)和基质辅助激光解吸附质谱技术(matrix assisted laserdesorption /ionization ,MALDI)是诞生于80年代末期的两项软电离技术。这两项技术的出现使传统的主要用于小分子物质研究的质谱技术发生了革命性的变革。它们具有高灵敏度和高质量检测范围,使准确分析分子量高达几万到几十万的生物大分子成为可能,从而使质谱技术真正走入了生命科学的研究领域,并使生物质谱得到了迅速的发展。与其他生物大分子的分析方法相比,生物质谱具有准确、快速、灵敏度高等特点,另外质谱分析自动化使大量合成寡核苷酸的快速分析成为现实。随着该技术的不断进步与完善,生物质谱已逐渐在核酸领域得到了广泛的应用。
单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism ,SNP )是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA 序列多态性 ,其在人群中发生几率超过1%,人类基因组DNA 序列 90%多态性是由 SNP造成的。SNP 位点处等位基因频率的测定往往需要对成千上万个样本进行分析,工作量非常巨大,因此急需一些高通量 、低成本的 SNP分型技术,以满足需求。生物质谱技术正好符合上述需求,特别是准确性方面,由于它检测的是寡核苷酸本身的一个物理性质——分子量,而不像其他检测方法是通过间接的方式 (如荧光的强度 、荧光的极化 、寡核苷酸的迁移率等 )来检测 。目前,确定特定 SNP 位点处等位基因的基因型方法有:等位基因特异的延伸法、等位基因特异的杂交法、等位基因的特异的酶切法、等位基因特异的连接法等。主要的分析手段包括:毛细管电泳 、检测荧光、荧光极化、质谱等,而现在用于SNP分型研究的质谱仪主要是 MALDI-TOF-MS。
(一)不同的 SNP 分型系统的应用
D.Niemeyera等人应用 GENOLINK 系统进行快速的SNP分型,首先进行 DNA 的 PCR 扩增 ,然后进行引物延伸反应,最后应用 MALDI -TOF -MS 方法检测SNP位点 ,结果显示所有相关的 SNPs 都可成功的分型。Mark Kokoris等人发展了一种以单四级杆质谱作为检测系统的 masscode 标记系统进行高通量 的SNP 基因分型,以此系统用于 DNA 的标记和检测。杨何义等人通过对生物质谱作为 SNP 分型的检测方法的研究,建立了 1 种基于生物质谱的 SNP 分型方法。
(二)对 Y 染色体的SNPs分型的应用
Y.P.Hou.等人应用 MALDI-TOF -MS 技术对 Y 染色体SNP 进行分型,目的是建立一种基于MALDI-TOF-MS 技术的 Y-SNP 的分析方法。Burkhard Berger等人应用在线液相色谱-质谱联用技术对法学中的 Y 染色体位点 M9 进行单核苷酸多态性分型。而 E.Petkovski 等人应用MALDI-TOF-MS方法分析古代样品中的 Y 染色体的 SNPs,其中包括古代蒙古、西伯利亚、南美洲等的DNA 样 品。J.Men—gel Jorgensen 等人应用MALDI-TOF-MS 技术对 17 种 Y 染色体 SNP进行分型,这一方法以单碱基延伸(SBE )引发剂的重量测定为基础。
(三)其他 SNPs 分型的应用
Harald Niederstatter等人应用 HPLC-TOF-MS 法对线粒体内的 DNA 混合物进行单核苷酸多态性的高效半定量基因分型,并评定了离子对反相HPLC –TOF-MS法对于单核苷酸多态性高效半定量基因分型的优点。Kenji Nakaia 等人使用MALDI-TOF-MS 技术检测以色列两种健康人群中与冠心病相关的 SNP 基因分型的种族差异。Stephanie Hahner 等人应用MALDI-TOF-MS技术对与常见的复杂疾病的危险性相关的SNPs 进行分析。Takuro Sasayarna 等人应用质谱法同时对Indels(核苷酸插入和缺失)和SNP进行分型,该方法中 ApoE 基因中的 indels 应用人工核糖核酸酶和MALDI-TOF-MS方法得到了精确的分型,RNA样品经人工核糖核酸酶处理后得到质谱分析用的RNA 碎片,序列中的 SNP 也同时得到了分型。综上,生物质谱在SNPs 分型中已得到了较广泛的应用,尤其是MALDI-TOF-MS技术以其高灵敏性、高准确度、分析速度快 、测量范围宽 、分辨率高、样品用量少等优点被广泛应用于生物大分子的检测。另外,还可应用工作站和自动控制软件以提高实验重复性,简化操作,同时还可以鉴别不同类型生物分子,从而高通量平行分析。
生物质谱与其他的检测生物大分子的方法相比,具有准确、快速、耗费低、易于大规模和高通量等优点 。这些优势使其能够对合成寡核苷酸进行质量监测和质量控制。质谱分析自动化使大量合成寡核苷酸的快速分析成为现实。由于生物质谱本身所拥有的优点及技术的不断完善,生物质谱已经在核酸分析基础研究领域得到广泛的应用。另外,生物质谱在靶性DNA 分析、法医遗传学等领域也有广泛的应用前景。
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