海光讲堂 | 汞元素形态分析样品前处理技术

为了能准确测定样品中的形态含量，必须有一个能够保证样品中的各个形态完整高效的转移到提取液中的样品前处理方法。在提取过程中，分析物和提取溶液、介质及提取容器壁会发生一些化学反应，可能会导致形态的损失或者转化，使得测定的结果不准确。形态分析常常需要一步或者多步萃取程序，一步萃取的方法相对比较简单，而且形态变化较小，但提取效率太低；而多步萃取方法可以根据不同形态的不同特征采取不同的萃取方法，能大大提高萃取的效率，但是由于经过几步转化，很难避免样品中的各形态的损失或者转化。

以汞元素为例，从实际样品中提取各种形态的汞最常用的是酸提取法和碱消解法。酸提取技术以20世纪60年代Westoo提出的在HCl介质中用苯从鱼肉中萃取甲基汞为代表，这一过程需要分几次才能得到纯净的甲基汞苯溶液。利用酸提取法可以萃取生物样品如鱼、软体动物、人尿、海豚肝脏中的汞形态，也可以萃取土壤、底泥中的汞形态。有机汞化合物被萃取到有机相层中后，加入适量的水，用氮气或者空气吹干有机相，或者直接用硫代硫酸钠或半胱氨酸反萃后直接进样。

生物样品用碱消解是一种非常有效的萃取方法, 萃取效率可达95%～105%。常用的碱消解试剂为四甲基氢氧化铵（TMAH）或25%氢氧化钾/氢氧化钠－甲醇溶液。加入碱消解试剂后振荡或者超声，待碱消解液冷却后，加入6mol/L盐酸酸化，然后加入甲苯或者二氯甲烷萃取，有机汞化合物被萃取至有机相中，无机汞仍残留在水相中，将有机相转移入样品管中，缓慢吹入氮气，将有机溶剂吹干后用流动相稀释进样或者直接用水定容可提高灵敏度，或者可用少量硫代硫酸盐溶液再次反萃取。对甲基汞化合物来说，碱消化法比常规苯萃取法的回收率要高，表明碱消化的效果更好，用碱消化法可测得鱼样中甲基汞的含量占总汞的95%。但是与酸相比，由于不易获得较纯的碱溶液，碱消解法容易导致样品的污染，此外，碱消解法还会导致样品基体中有机物、硫化物或有色金属离子与汞化合物共萃取，给后续的分离测定带来严重干扰。

2.1  大米样品中甲基汞和乙基汞的测定

大米样品室温下干燥，用研磨机研碎，过40目筛。

称取2.00g米粉于50mL玻璃离心管中（对于回收率研究，在米粉样品中加入适合的有机汞的标准物质）。加入5mL Milli-Q水，随后加入4mL酸化的KBr/CuSO₄（3：1）。机械摇动离心管过夜，接着加入6mL CH₂Cl₂摇动1h，萃取有机汞到CH₂Cl₂相中。在2000rpm/min下离心10min后，4mL CH₂Cl₂相转移到7mL的玻璃管中，用1mL 0.01mol/L Na₂S₂O₃ 萃取。摇动45min来提高萃取效率。放置几分钟使溶液分离。(0.6-0.8)mL水相转移到3mL微离心管中。接着加入0.3mL酸化的KBr/CuSO₄（3：1）溶液和0.5mL CH₂Cl₂。萃取物被快速的摇30min，在5000rpm下离心15min后测定。

2.2  生物参考试样中无机汞和甲基汞的测定（标准参考物质：CRM463、DORM-1和TORT-1）

将(0.1-0.5)g冻干组织试样和5mL萃取剂溶液置于萃取管中，并暴露于一定功率(20-80)W的微波辐射中(1-4)min。萃取后，将试液冷至室温，然后用5mL甲醇稀释，振荡均匀，过滤后测定。 

甲基汞的提取效率顺序：硝酸、盐酸、乙酸、TMAH和甲醇-KOH溶液。

2.3  鱼样品中汞的形态分析

分别称取0.025g DORM-2角鲨鱼样品（National Research Council of Canada, Ottawa, Canada）和旗鱼样品各三份于Teflon消解容器中。加入25ml萃取溶液，萃取溶剂为0.05%( m/v)L-cysteine+0.05%(v/v)2-mercaptoethanol(巯基乙醇)。接着样品放入微波消解器中，在60℃条件下，暴露于微波下2min，1min达到所需温度。样品冷却到室温后，离心5min，取上层清液测定。

2.4  海产品中甲基汞和总汞的测定

称取均匀可食用部分的海产品(0.5±0.05)g（最大0.65g，依赖于均一化样品时所加入的含水量）或冻干的参考物质(0.2±0.02)g于60mL琥珀色玻璃萃取管中，盖紧盖子，储存于冰箱中，(3-10)℃条件下过夜。在萃取管中加入(50±0.5)mL 1%(w/v) l-cysteine.HCl.H₂O萃取液。盖紧萃取瓶，用手剧烈地摇(15-20)s后，放于水浴中，保持(60±4)℃ 120min，期间用手剧烈地摇溶液至少2次，每次(15-20)s，加热120min 以后，萃取瓶放入(22±5)℃的水中(10-15)min，萃取管冷却到室温后，萃取液过滤，测定。

2.5 金枪鱼样品中汞形态分析方法的比较  

（1）25% KOH/甲醇(w/v)碱性萃取

称取0.3g样品于离心管中，加入3mL 25% KOH/甲醇(w/v)溶液，样品放入70℃的水浴中加热30min后，再超声30min。萃取程序重复3次，萃取完后，上清液在3500rpm下离心10min。消解液接着被转移到另一个新的离心管中，分析之前，样品用4mol/L醋酸调节pH至4.0。

（2）上述萃取程序用10mL 25% TMAH-甲醇(w/v)溶液也可，萃取过程同上。

（3）5% TMAH/甲醇(w/v)碱性萃取

称取0.2g样品于微波消解罐中，加入2mL 25% TMAH/KOH(w/v)溶液，用超纯水定容至10mL。微波程序：步骤1，室温至180℃，10min；步骤2，180℃，10min。消解罐冷却至室温，消解液经0.22μm玻璃纤维过滤器过滤。分析之前，样品用4mol/L醋酸调节pH至4.0。  

2.6 鱼组织样品中总汞和甲基汞的分析

精确称取冻干样品0.5g于干净的100mL Teflon消解罐中。加入10mL 5mol/L HCl和0.25mol/L NaCl。一个3cm长的Teflon搅拌棒放于消解罐中，用于微波萃取过程中搅拌样品。密封消解罐，在60℃照射10min。3min达到设定的60℃。微波加热后，冷却至室温，在3000rpm下离心20min，上层清液用0.22μm玻璃纤维过滤器过滤，测定。  

2.7 鱼样品中甲基汞的分析

（1）称取(1.5-2.0)g样品，用少量水先润湿，加入HCl和甲苯，摇15min，离心，甲苯萃取液转移到一个分液漏斗中，加入半光氨酸溶液，摇15min，离心后，水相被移出，用甲苯反萃取，萃取液直接测定。

（2）称取(0.8-1)g样品，加入H₂SO₄，然后用甲苯萃取。萃取液直接测定。

（3）称取大约0.25g的样品，用HCl萃取2次，合并萃取液，调节pH为(4～6)，过滤后测定。UV灯照射前后测试结果的差值为甲基汞的含量。

（4）称取0.3g样品，加入0.5mL含H₂SO₄(9mol/L)的20% KCl水溶液，在145℃条件下蒸馏。馏分用去离子水定容到10mL，调节pH至6.0，进样。

2.8 沉积物标准参考样品中甲基汞的测定

称取大约1g干燥均匀的沉积物于萃取管中，加入10mL 2mol/L硝酸，在60W条件下微波照射3min。微波照射后，样品溶液转移到一个15mL的离心管中，在5000rpm离心5min，取上层清液，用醋酸盐缓冲液调节pH至4.0，用水定容，测定。

2.9 土壤样品中无机汞和甲基汞的测定

精确称取土壤样品(0.50±0.01)g于50mL聚丙烯离心管中，加入5mL CH₃OH和100µL 6mol/L HCl。样品在微波炉中被萃取，微波程序保持30％功率20min，样品萃取后，溶液冷却至室温，固液分离。样品用去离子水稀释到10mL，经0.45μm的尼龙滤膜过滤后进样。

2.10 农田土壤中甲基汞和乙基汞的测定

称取4.000g农田土壤于100mL锥形瓶中,加入5滴浓HNO₃。用10mL pH4.0 HAc/NaAc缓冲溶液浸泡24h后,以2000rpm/min的速度离心10min。取上层清液经0.45μm滤膜过滤后测定。

2.11 沉积物物中甲基汞的测定

（1）蒸馏法

① 称取0.25g样品，加入1mL 10%NaCl和1mL 50%H₂SO₄，用去离子水稀释到10mL，在140℃条件下，以(8-10)mL/min的速度蒸馏，馏分用去离子水定容到10mL，取3mL溶液用5%NH₄OAc调节pH至6.0，进样。

② 称取样品0.2000g，加入500µL H₂SO₄(8mol/L)和200µL 20%NaCl蒸馏，溶液用二次去离子水稀释至10mL。在145℃，60mL/min氩气流条件下，以(6-8)mL/h的速度蒸馏(75-90)min。馏分被收集在一个玻璃瓶中，保持在冰冻的水浴中。馏分被稀释至10mL，取5mL溶液用0.1mmol/L醋酸铵调节pH为6.0，进样。

（2）甲苯萃取法

称取1g样品，加入7mL HCl(6mol/L)萃取，用5mL甲苯萃取2次，用1mL Na₂S₂O₃反萃取，萃取液过滤后测定。 

2.12 土壤/沉积物中汞的形态提取

沉积物中甲基汞的提取，可采用乙酸、硝酸、KBr-H₂SO₄-CuSO₄混合液及NaBr-Na₂SO₄(3:1)-H₂SO₄(5%)为提取液，提取可在微波场的作用下进行。此文献萃取程序如下：

称取(0.1-1)g试样，加入5mL水和5mL冰醋酸提取溶剂于微波消解管中，微波萃取4min。萃取液调节pH为6.0左右，溶液经0.45μm滤膜过滤后测定。

2.13 沉积物中甲基汞的测定

精确称取0.2g的沉积物样品，加入5mL H₂SO₄ 溶液，放于100℃的水浴中加热30min。消解液用甲苯萃取，然后反萃取到硫代硫酸盐中。

2.14 沉积物试样中汞的形态分析

称取沉积物试样1.0g，悬浮在10mL 6mol/L HNO₃中，置于60W微波炉中照射3min后，在5000r/min下离心，分离出悬浮液，储存备用。 

2.15 冻干组织试样中汞的形态分析

称取0.5g冻干组织试样于15mL容量瓶中，加入2mL NaOH(10%，质量分数)，在80℃下加热4h后，用乙酸调节pH为4.0（加3mL缓冲液）。然后，加入1.5mL NaBEt₄溶液(0.4%，质量分数)，振荡1h。最后，将溶液萃取至有机相戊烷中。再于2500r/min下离心，取悬浮液用于柱分离。

备注：以上样品前处理方法来自文献。

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