沃方案 | 采用REIMS分析NCI60细胞组的脂质特征

2019-02-20 09:17:24, Waters 沃特世科技（上海）有限公司

液相质谱（LC-MS）是分析生物样本中脂质谱系的传统方法，然而，即使是使用最先进的超高效液相质谱（UPLC-MS）进行脂质组学分析也需要10-20分钟，这其中还不包括样品前处理（包括匀浆、提取及氮吹等）所需要的时间。

近年来常压敞开式离子源质谱技术（AMS）的出现为脂质研究领域带来了新动力。快速蒸发电离质谱（REIMS），一种常用的AMS，是近年来开发的一种用于手术中组织鉴定的分析质谱。

如图1所示，REIMS分析样品时，生物样品通过手术钳以焦耳加热的方式迅速加热，产生的气溶胶直接进入质谱仪进行检测。REIMS检测的物质主要是来源于细胞膜的复杂磷脂，并且这些磷脂显示出高度的组织学或者组织病理学特异性，因此REIMS可以作为一种快速脂质组学分型技术。

图1： REIMS分析细胞系脂质谱系的实验装置

细胞系是研究不同生物化学过程及疾病的一种有效的体外研究工具。NCI60细胞组是由美国国家癌症研究所筛选的含有60种人源癌细胞系的细胞组，这些细胞系来源于9种不同的器官，包含肺、结肠、脑、卵巢、乳腺、前列腺和肾。

目前对于NCI60细胞组的研究比较深入，包括对超过10万种化合物和天然产物的药敏模式、蛋白组、基因组以及与肿瘤相关的常见突变点等，但是相应的代谢组和脂质组数据还相对比较稀缺。这里我们采用REIMS来分析NCI60细胞组的脂质谱系，进而为REIMS运用于组织鉴定的分子背景提供数据支撑。

实验方法

NCI60细胞组和HEK、Hela和MES-SA细胞系按照常规的细胞培养流程培养，在80-90%密度时，用胰酶消化后离心去除液体，并用PBS清洗2次，去除液体后于-80℃储存，用REIMS进行脂质组学分析。

实验结果

REIMS分析细胞脂质谱系展现出良好的脂质质谱

信号

为了验证REIMS质谱信息的可重复性以及是否能够充分地区分不同的人源癌细胞系，三种细胞系包括宫颈腺癌细胞系Hela、子宫肉瘤细胞系MES-SA及恶性胶质瘤细胞系SNB-19用来检测REIMS质谱信息的可重复性。

结果如图2A所示，三种细胞系的REIMS信号图谱表现出高度的一致性，且这些信号大部分都是脂质的信号，包括磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰甘油（PG）以及神经酰胺（Ceramide）等（具体数据未展示）。这些获得的脂质信号通过PCA分析能明显区分这三种细胞（图2B）。

3组独立的针对Hela、MES-SA和SNB-19细胞脂质信息的PCA分析实验用来进行交叉验证，结果如图3所示，SNB-19的三次独立实验都显示出了高于98%的准确度，而Hela和MES-SA细胞之间会有偶发性的错误分类，这说明与SNB-19相比，Hela和MES-SA细胞的之间具有比较相近的脂质信息，该结果与图2的PCA分析结果是一致的。

图2: A) Hela、MES-SA和SNB-19细胞通过REIMS分析得到的m/z 600-900质谱谱图

B) 多批次Hela、MES-SA和SNB-19细胞REIMS数据的三维PCA图

图3使用包含4个主成分的PCA模型和3最近邻作为分类标准对Hela、MES-SA和SNB-19细胞进行交叉验证的结果

NCI60细胞组的REIMS信号分析

接着用包含60种人源癌细胞系的NCI60细胞组来探索REIMS对这些细胞的区分效果。图4显示的是对67种细胞（NCI60中有一种细胞没有检测，8种细胞设置了2个重复）所测得的脂质进行层次聚类分析（HCA）的结果。对细胞系之间的脂质谱系进行分析，发现这些细胞的脂质类别相同并且没有自己特有的脂质，同时用于聚类分析的信息主要是脂质模式水平的差异而不是某些脂质含量的差异。重复细胞之间显示出了非常良好的HCA聚类效果，除了IGROV-1和SF-268，这可能跟IGROV-1采集到的质谱数据较少以及SF-268的高度生物变异相关。

MDA-MB-435细胞是一种人乳腺癌细胞系，它的基因表达谱显示MDA-MB-435更像是黑色素瘤细胞系。REIMS脂质谱系聚类分析显示MDA-MB-435与黑色素瘤细胞系M14具有非常好的聚类效果（图3右边蓝色箭头所示）。染色体核型分析发现NCI-ADR-RES其实是OVCAR-8的一种耐药衍生形式，这两种细胞的REIMS脂质谱系也显示出良好的聚类效果（图3左边蓝色箭头所示）。

总而言之，REIMS脂质谱系与癌细胞系的生物学特征密切相关，能很好地鉴别不同癌细胞。

图4：NCI60细胞组的聚类谱系图

NCI60细胞组包含来源于卵巢（OV，绿色）、肾脏（RE，棕色）、黑素瘤（ME，淡蓝色）、中枢神经系统（CNS，淡绿色）、乳腺（BR，黑色）、肺（LC，蓝色）、结肠（CO，红色）、白血病（LE，紫色）和前列腺（PR，黄色）的67种细胞，其中8种细胞系具有2个重复（星形标注），蓝色箭头标示的是生物学相关的细胞系

支原体感染细胞系的REIMS信号分析

支原体感染是用细胞系进行基础研究和应用研究过程中经常遇到的一个问题，它能改变细胞的许多生理学过程进而影响实验结果。进行细胞培养时常用PlasmocinTM来预防和根除支原体。

用REIMS分析感染支原体与否的HEK和Hela细胞，发现与未感染支原体的细胞相比，感染支原体的HEK细胞和Hela细胞中分别有23和386种显著增强的质谱信号，其中有18种信号是共有的（图5A），而仅有1种质谱信号是下降的（数据未显示）。用这18种上升信号对这些细胞进行PCA分析发现第一主成分能很好地区分HEK细胞和Hela细胞，而第二主成分能很好地区分感染支原体的细胞和未感染支原体的细胞，同时PlasmocinTM处理的感染支原体的细胞与未感染支原体的细胞聚集在一起（图5B）。这些数据说明REIMS分析能很好地反应细胞受支原体感染情况下质谱信号的变化。