【最新进展】BioNMR甲基化标记突破蛋白分子量限制（文末福利）

2025-03-31 17:51:40 青岛腾龙微波科技有限公司

核磁共振（NMR）光谱法已成为溶液中蛋白质结构、动力学，以及分子间相互作用研究的首要工具。然而，其关键局限在于只能研究相对较小的蛋白质。近来，同位素标记技术的进步、基于 TROSY 方法的发展以及低温探头的出现，扩大了蛋白质 NMR 研究的尺寸限制。一种广泛使用的同位素标记方案是全氘化，已被证明能减轻快速异核（如 13C 和 15N）弛豫。但这种标记方案的一个显著缺陷在于，它极大地减少了可用于蛋白质结构测定的 1H-1H NOE 的数量。

为了在全氘化蛋白质中测量结构信息丰富的 NOE，Kay 及其同事展示了使用特定的α-酮酸前体选择性地对异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸残基的甲基进行质子化（本文中简称为 ILV）。这些残基中甲基的 1H 和 13C 选择性掺入使得能够以高灵敏度和分辨率测量出具有结构信息的核磁共振偶合（NOE）。异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸残基含量丰富（约占所有残基的 21%），且常位于球状蛋白质的疏水核心内。这些因素有助于对大量长程酰胺 - 甲基和甲基 - 甲基 NOE 进行分配和测量，从而能够确定相对较大蛋白质的整体折叠。Tugarinov, et al.等人通过几乎完全分配异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸甲基共振以及确定 723 个残基的酶苹果酸合酶 G（MSG）的整体折叠，证明了特定甲基质子化的实用性，并且有助于突破蛋白质核磁共振的大小限制。以下是目前可用的异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸甲基组标记方案的简要概述，以及这些方案如何与当今的蛋白质核磁共振方法相结合。

使用α-酮酸生物合成前体可以实现

多种标记方案。

特定甲基质子化与侧链 13C 均匀标记。通过使用不同的同位素标记α-酮酸前体与现有的标准均匀同位素标记程序相结合，可以生物合成地实现几种不同的异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸（ILV）标记模式（图 1）。例如，有可用的前体，与使用 15N 氯化铵、U-13C/D 标记的葡萄糖和 D2O 相结合，可在非甲基 ILV 侧链位点实现 13C 和 D 标记，并在缬氨酸和亮氨酸残基的一个或两个甲基（以α-酮异戊酸的形式给出 13CH3/13CH3 标记模式）以及异亮氨酸的δ1 甲基（使用α-酮丁酸）上实现 13C 和 1H 标记（图 1A）。这种标记方案是通过在用 IPTG 诱导蛋白质表达约一小时前，向基于 D2O 的标准最小培养基中分别添加α-酮丁酸和α-酮异戊酸的钠盐（分别为 60 毫克/升和 100 毫克/升）来实现的。这些前体可以一起使用，也可以单独使用，而不会在异亮氨酸和缬氨酸/亮氨酸残基之间发生混杂。

这种标记方案在多肽主链与 ILV 残基的 13C/1H3 甲基基团之间形成了连续的 13C-13C 键网络，并且与核磁共振实验兼容，这些实验可将磁化从甲基基团转移到其他侧链 13C 位点、主链位点以及反向转移，或者从甲基基团转移到侧链 13C 位点。当先前已确定了连续的主链共振分配时，这种标记模式和这些实验用于将 ILV 甲基共振分配给一级序列中的特定氨基酸。以这种方式标记的蛋白质样品还可用于记录 3D 和 4D 13C 和/或 15N 编辑的 NOESY 数据，从中可以得出酰胺-甲基和甲基-甲基距离限制，并确定结构。

多伦多大学Lewis Kay团队展示了选择性甲基质子化的作用。Kay的团队开发了用于在具有甲基质子化异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸自旋系统的蛋白质中进行甲基基团分配的 1H 核磁共振实验。这些 1H 甲基检测“往返”实验包括 HMCM(CG)CBCA、Ile、Leu-HMCM(CGCBCA)CO 和 Val-HMCM(CBCA)CO 实验。这些实验非常灵敏，分别在 800 MHz 的室温探头下，使用 0.9 mM 的蛋白质样品，在 59、58 和 21 小时内完成采集。利用这些实验，能够对 82 kDa 蛋白质（MSG）中近 78% 的异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸甲基基团的 1H 甲基（1Hme）和 13C 甲基（13Cme）共振进行分配。随后，3D 和 4D NOESY 实验的分配提供了距离限制信息，当与其他类型的结构限制相结合时，能够确定该 723 残基蛋白质的明确全局折叠。

最近，开发了一种 3D 13C 检测的 CH3-TOCSY 实验，该实验能够将 ILV 质子化自旋系统中的 1Hme 和 13Cme 化学位移与 13Caliphatic 化学位移相关联（图 2）。Jordan, et al.等人利用该实验为一个 14 kDa 的蛋白质结构域获得了 ILV 甲基基团的化学位移分配。这些分配随后被用于分配使用相同 ILV-13C/1H 标记的蛋白质样品记录的 3D 15N- 和 13CNOESY-HSQC 光谱。13C 检测的 CH3-TOCSY 实验需要使用能够直接检测 1H 和 13C NMR 信号的低温探头，并且在 1 mM 蛋白质样品中约 16 小时内完成采集。使用 13C 检测能够获取直接检测碳维度中的非常高的分辨率数据，从而有助于对 ILV 13C/1H 甲基共振进行序列特异性分配。从 ILV-13C/1H 标记样品的 3D NOESY 光谱中获得的有限距离信息足以获得 14 kDa 蛋白质的明确全局折叠。此外，该研究小组还证明，采用 ILV-13C/1H 标记的 CH3-TOCSY 实验在 42 kDa的二元蛋白质复合物背景下，能够有效地对 10 kDa的蛋白质进行类似的归属。

选择性地对异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸（ILV）甲基进行 13C/1H 标记以创建

孤立的甲基自旋探针

α-酮丁酸和α-酮异戊酸的甲基前体也可仅在甲基中引入 13C 和 1H（α-酮异戊酸中可仅在一个或两个甲基中引入），其余碳原子以 12C 和 D 标记存在（图 1B）。这种方法可产生孤立的 13C/1H 标记的 ILV 残基甲基，这些甲基与其它 13C 核素无标量耦合，因此在使用 1H 解耦时表现出单线线型，并具有良好的弛豫特性。对于 L 和 V 残基，当仅将两个甲基中的一个标记为 13C/1H 时，甲基的弛豫特性最佳。虽然这将每个甲基中 13C 和 1H 同位素标记的量减少了一半，但信号损失通过改善弛豫得以补偿，从而导致甲基共振峰更窄。此外，L 和 V 残基中两个对映甲基之间的甲基-甲基弛豫消除，使得这些残基与其它 ILV 甲基之间的 NOE 相互作用能够在长距离（e.g.up to 8 Å）上被观察到。这种标记策略通常与除异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸（ILV）甲基以外的脂肪族位点的均匀 15N 和 D 标记相结合，通过适当的 3D 和 4D 13C 和/或 15N 编辑的 NOESY 核磁共振实验，能够观察到长程酰胺-甲基和甲基-甲基 NOE。当除 ILV 甲基以外的所有脂肪族位点都标记为 12C 和 D 时，长程 NOE 的观察效果最佳，这可以通过以 U-12C/D-葡萄糖作为唯一碳源和 D2O 作为溶剂的生物合成标记来实现。如果使用天然丰度的葡萄糖和 D2O 作为溶剂（这更经济），脂肪族位点（除特定的 1H/13C 标记的 ILV 甲基以外）将被 D 标记至约 70%的程度。

除了上述应用之外，特定的 1H/13C 标记的异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸甲基基团已被用作蛋白质 - 配体相互作用的报告基团。这种方法是使用 1H/15N 酰胺基团作为相互作用探针的有吸引力的补充，因为 2D 1H/13C 化学位移相关光谱可以高灵敏度记录，并且小分子以及大分子通常在由甲基基团组成的疏水口袋或疏水表面上结合。对于已知结构的蛋白质，这允许基于结合诱导的甲基基团化学位移变化来确定小分子的结合位点。对于小的 1H/13C 标记的异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸甲基蛋白质，2D 1H/13C HSQC 光谱可以快速（约 10 分钟）记录，且蛋白质溶液相对稀释（约 50 μM）。使用低温探头可进一步降低这些要求。此外，Kay 及其同事已经表明，对于大蛋白质或蛋白质复合物（分别为 82 kDa 和 305 kDa），由于“甲基 TROSY”效应，2D 1H/13C HMQC 光谱表现出更高的灵敏度和分辨率。例如，Hamel,et al.等人描述了利用甲基-TROSY 核磁共振技术绘制 120 kDa CheA-CheW 复合物蛋白质-蛋白质界面处的残基，而Hajduk, et al.等人则证明，在高通量小分子筛选中使用选择性异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸甲基标记，可使 1H-13C HSQC 光谱的信噪比比相应的 1H/15N HSQC 光谱高出三到五倍。

选择性对异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸甲

基进行 2H/13C 标记以用于蛋白质动力

学的 2H 和 13C 核磁共振弛豫研究。

上述讨论的主题通常集中在利用特定标记的甲基来探究蛋白质结构以及监测蛋白质 - 蛋白质和蛋白质 - 配体相互作用。人们普遍认识到，甲基也是蛋白质侧链动力学的探针。特别是，对均匀 13C 标记和部分 D 标记的甲基中 D 和 13C 自旋弛豫行为的研究，拓展了我们对蛋白质侧链动力学的认识。在这些研究中，每次仅监测一种甲基同位素异构体的弛豫行为。由于在细菌生物合成过程中，氘和氢会随机掺入脂肪族位点，因此在特定位点（例如异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸甲基）具有特定同位素异构体的分子浓度仅占总蛋白质浓度的一部分。因此，将具有均匀同位素组成的 ILV 甲基基团同位素异构体（例如用于 D 和 13C 松弛研究的 13CHD2纳入其中，将提高光谱的信噪比，并将这些实验的应用范围扩展到更广泛的蛋白质系统（图 1C）。实际上，Kay 及其同事在对 MSG（一种 82 kDa 和 723 个残基的蛋白质）以及总质量为 670 kDa 的 20S 蛋白酶体的研究中使用了这种方法。

总结与展望——新视野在等待

正如开头所讨论的，核磁共振波谱法是研究蛋白质结构、蛋白质动力学以及蛋白质与其配体相互作用的强大工具。特定的异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸甲基标记的使用对于将基于核磁共振的全局折叠测定的大小限制扩展到约 80 kDa至关重要。由于这种同位素标记策略既经济可行又广泛可用，因此能够开展此类具有挑战性的蛋白质结构研究。随着这种标记策略在核磁共振/结构生物学界得到更广泛的应用，我们期待未来涉及更具挑战性的生物分子系统的应用。如上所述，其应用范围不仅限于结构测定和配体图谱绘制。例如，在 2005 年，Kay 及其同事报告了对 300 kDa的蛋白酶 ClpP 进行异亮氨酸甲基标记，并使用甲基 TROSY 方法检测到毫秒时间尺度上的构象交换过程。据认为，这种交换过程与 ClpP 桶状结构中线孔隙的打开以释放产物有关。这个例子说明了如何将 X 射线晶体学提供的 ClpP 的整体结构信息与核磁共振波谱学提供的直接与催化循环关键步骤相关的动态信息相结合，从而揭示复杂的分子机器如何执行其生物学功能。随着同位素标记技术的进步以及由此带来的新核磁共振方法的实施，我们已经掌握了工具，能够拓展对生物分子结构、动态和功能之间关系的认识。

青岛腾龙作为美国剑桥CIL同位素中国区总代理，提供种类繁多的α-酮丁酸和α-酮异戊酸，以及丙酮酸，用于选择性甲基和侧链标记。这些前体的均匀 13C 标记形式与 13C6 葡萄糖结合使用，可生成均匀 13C 标记的异亮氨酸和亮氨酸。CIL 还提供用于蛋白质标记的试剂盒，其中包含异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸和丙氨酸（即“ILVA”标记）或仅丙氨酸的组合套装。这些试剂盒适用于 1 升量的氘代基本培养基。甲硫氨酸（2，3，3，4，4-D5，甲基-13CH3）和苏氨酸（4-13C；2，3-D2）也可用于氘代基本培养基，以提供除亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和丙氨酸之外的新甲基探针。

α-酮酸