如何分析致幻蘑菇中裸盖菇素、相关色胺类和β-咔啉类化合物？

本文所述研究开发了一种用于分离10种色胺和β-咔啉类化合物的HPLC方法。这些化合物的化学结构如图1所示。在方法开发过程的优化步骤中，使用Empower SSG自动创建仪器方法。至关重要的是，利用Waters^™ MaxPeak HPS技术可大幅降低分析物与金属氧化物发生相互作用的相关风险。 

图1. 本研究中使用的所有10种化合物的化学结构和相应的m/z。

• 与标准不锈钢HPLC系统相比，使用MaxPeak HPS技术可显著改善色谱性能。

• 一种更加绿色环保的方法，使用更环保的甲醇作为强溶剂开发。

• 一种仅需15 min即可使一组色胺和β-咔啉类化合物实现基线分离的方法。

• 使用Empower样品组生成器快速创建仪器方法和样品组。

裸盖菇素和脱磷酸裸盖菇素购自Sigma Aldrich(德国达姆施塔特)，分别溶于1:1乙腈:水中。4-磷酰氧基-N-甲基色胺、铜绿菌素、4-磷酰氧基色胺、去甲脱磷酸裸盖菇素、哈尔满、哈尔明、去甲哈尔满、去甲骆驼蓬碱均购自Caymen Chemicals(美国密歇根州)。

使用标准品制备一组色胺和β-咔啉类化合物，模拟致幻蘑菇中的活性化合物。这些化合物通常使用甲醇提取7。为反映这一点，使用5%水、5%乙腈和90%甲醇制备一组包含所有10种化合物的样品，裸盖菇素、脱磷酸裸盖菇素、4-磷酰氧基-N-甲基色胺、铜绿菌素、4-磷酰氧基色胺、去甲脱磷酸裸盖菇素和去甲骆驼蓬碱的浓度为0.05 mg/mL，哈尔满、哈尔明、去甲哈尔满的浓度为0.025 mg/mL。

• 液相色谱条件

• 梯度表

在方法开发过程中筛选了四种选择性各不相同的色谱柱，分别是：XBridge™ Premier BEH C₁₈、XSelect Premier CSH C₁₈、XSelect Premier CSH苯己基和XSelect Premier HSS T3。所有色谱柱的尺寸均为2.5 μm，4.6 x 100 mm。筛选过程中同时使用了PDA和QDa质谱检测器进行峰鉴定。数据表明，分析物在XSelect Premier HSS T3色谱柱上获得的色谱峰形和保留性均更好。由于XSelect Premier HSS T3色谱柱表现出优异的性能，因此选择该色谱柱用于进一步的方法优化。

方法优化步骤利用Empower SSG研究梯度时间、强溶剂百分比、温度、流速和强溶剂类型等参数。使用此应用程序时，用户必须创建一个可以导入SSG的CSV电子表格。按照提示操作后，应用程序将按照设定的规格创建样品组。这样可以降低单独创建仪器方法和样品组时的出错率并节省时间。

分析优化数据时，将代表铜绿菌素和4-磷酰氧基-N-甲基色胺的第二个和第三个色谱峰鉴定为关键分析物。在最终方法中，这两种化合物实现了基线分离，USP分离度为1.95，如图2所示。该方法使用相对较低的柱温25 °C，流速为0.75 mL/min，梯度时间更短，甲醇在9 min内从12%增加至55%。使用甲醇与使用乙腈相比，得到了更出色的保留性和色谱性能，此外，甲醇还是一种更加绿色环保的溶剂，因此被选择用于最终方法。

图2. 在采用MaxPeak HPS技术的Arc Premier系统和色谱柱上运行最终方法生成的代表性色谱图。

所有已知化合物在基线处测得的USP色谱分离度值均接近2。研究发现，所有峰的峰拖尾均满足要求，仅去甲哈尔满化合物的拖尾因子大于1.5。图3列出了每种化合物在采用MaxPeak HPS技术的Arc Premier系统和色谱柱上得到的分离度和拖尾因子。

表1. 在Arc Premier系统上运行最终方法得到的色谱峰分离度和拖尾。

为评估MaxPeak HPS技术的影响，在配备标准色谱柱的标准不锈钢ACQUITY Arc系统上运行了相同的分析，所得的色谱图见图4。与标准不锈钢相比，使用MaxPeak HPS技术时，此分析中化合物的色谱峰高和峰面积都有所增加。值得注意的是，使用MaxPeak HPS技术时，去甲哈尔满的峰高、峰面积显著增加，拖尾因子从2.3降至1.6。

图3. 在采用标准不锈钢硬件和色谱柱的ACQUITY Arc系统上运行最终方法得到的代表性色谱图。

我们在两种HPLC配置上使用该方法运行了十次重复进样。实验结果见图5和图6。计算结果表明，该技术可以降低色谱峰面积和峰高的相对标准偏差，从而提高方法的重现性。

表2. 在标准不锈钢表面与MaxPeak HPS表面上分析得到的色谱峰面积比较。

表3. 在标准不锈钢表面与MaxPeak HPS表面上分析得到的色谱峰高比较。