Adv Sci | 中国科学院张丽华团队：空间蛋白质组学锁定阿尔茨海默病异构体“元凶”

激光显微切割质谱分析（LCM-MS）与质谱成像（MALDI-MSI）是目前较为成熟的两种空间蛋白组学技术，二者在检测扫描速度和蛋白质鉴定深度之间各有优劣。MALDI-MSI检测速度快但蛋白质通量很低，LCM-MS能达到很高的蛋白质鉴定通量但检测速度较慢，将两种技术联合应用，取长补短，是未来空间蛋白组学的趋势。

阿尔茨海默症（Alzheimer’s Disease, AD）的研究长期以来都试图从分子表达层面寻找答案。然而往往忽略了一个关键问题：蛋白质形态（proteoforms）的空间分布，也可以称为蛋白质异构体，即同一基因表达的不同结构的蛋白质。空间蛋白质组学可以一次性满足这两个需求：同时研究蛋白质形态及其空间分布情况！

近日，中国科学院大连化学物理研究所张丽华团队在《Advanced Science》发表了题为”High-Throughput Proteoform Imaging for Revealing Spatial-Resolved Changes in Brain Tissues Associated with Alzheimer’s Disease”的研究论文，提出了一种名为高通量蛋白质形态成像（HTPi）的创新技术，通过激光显微切割（LCM）与质谱成像（MALDI-MSI）两种空间蛋白组学技术联合，全球首次实现全脑蛋白质异构体"超清地图"绘制，成功揭示了AD模型小鼠脑内与淀粉样蛋白β（Aβ）病理相关的关键蛋白质形态变化与不同空间分布模式。本文将重点探讨激光显微切割质谱空间蛋白技术与成像质谱技术联用的科学逻辑。

1. MALDI-MSI成像：以100μm分辨率扫描小鼠大脑14µm脑切片，4小时内生成5567个像素点的质谱数据。

2. 相邻切片LCM切割：从与成像切片相邻的30 μm厚切片中切割特定脑区样本（如海马下托区域）。

3. 整合两种技术，构建高通量蛋白质形态成像（HTPi）数据库，成功实现小鼠脑组织366个蛋白质形态的高通量成像注释，但由于激光参数与基质涂层等限制，目前检测的蛋白分子量限制在20kDa以下。

4. 应用HTPi验证Pcp4等基因产生的不同蛋白质形态在小鼠纹状体、丘脑等脑区的特异性分布。

5. 在50μm分辨率下发现海马下托（SUB）区域特异性富集14个差异蛋白质形态（如Ubb截短体），并证实其与Aβ沉积的共定位关系。

6. Mbp乙酰化形态减少与髓鞘损伤、Ubb截短体异常与泛素-蛋白酶体系统失调相关。

• LCM技术：虽可高通量鉴定蛋白质，但需逐一切割每个区域，耗时高，无法高通量成像。

• MALDI-MSI：成像速度快，但鉴定蛋白质形态的灵敏度和覆盖度低（受限于气相碎裂效率）。

• 关键科学问题：如何实现高空间分辨率、高通量、高覆盖度的蛋白质形态分析？

1. MALDI-MSI负责成像，利用其快速成像能力（7小时/cm²，100μm分辨率）生成蛋白质形态的空间分布图谱。

2. LCM驱动自上而下蛋白质组学，从相邻切片切割特定脑区，通过质谱鉴定蛋白质形态，分析区域特异性蛋白表达谱。

3. 将MALDI-MSI成像数据与LCM鉴定数据库匹配（±0.05%质量容差），提升注释准确性。

通过对6月龄野生型（WT）与5×FAD模型小鼠进行MALDI-MSI成像以及相邻切片LCM切割质谱分析，对比脑区蛋白质形态差异。聚焦区域为海马体（HP）、皮层（CTX）、丘脑（TH）及海马体亚区（SUB）。

图1. HTPi工作流程

结果发现AD小鼠海马体下托（SUB）区域特异性富集Aβ(1–38/40/42)等病理相关形态，与硫黄素S染色显示的淀粉样斑块定位一致；关键蛋白质如钙调蛋白调节因子Pcp4的6种剪切/修饰形态（如Pcp4(2–62)@Ac）呈现脑区特异性调控，提示其可能参与Aβ聚集。此外，髓鞘碱性蛋白（Mbp）的乙酰化形态普遍下调，暗示髓鞘损伤加剧Aβ沉积；泛素B（Ubb）的剪切形态Ubb(1–72)在SUB区域特异性上调，可能通过竞争性抑制胰岛素降解酶（IDE）活性，阻碍Aβ清除。

图2. 野生和AD小鼠脑组织切片中蛋白质形态的空间分布

图3. 高分辨捕捉SUB中的Aβ蛋白变体

技术联用显著提升了注释覆盖度（单次实验注释366种形态，是传统MALDI-MSI的10倍以上）和空间分辨率（50μm下发现14种SUB区域差异形态），并通过免疫荧光和病理染色交叉验证了结果的可靠性，为AD的分子机制提供了新见解如线粒体功能障碍与泛素系统失衡的亚区特异性关联。

图4. 高通量、高分辨分析SUB中差异蛋白

激光与矩阵涂层：MALDI-MSI使用Smartbeam II 2 kHz激光器（波长337nm），正离子模式。组织切片经α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）基质分30层喷涂，每层间隔60秒干燥。

空间分辨率与扫描速率：全脑切片以100μm分辨率扫描（7小时/cm²），海马体亚区提升至50μm分辨率。每个像素点采集500次激光脉冲，质荷比范围覆盖2500–20000Da。

样本预处理：脑组织切片（30μm厚度）经固定（70%乙醇、100%乙醇、Carnoy溶液）和真空脱水后，贴附于聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）膜载玻片，-80°C保存备用。

激光切割设备与参数：使用PALM MicroBeam系统（卡尔蔡司），激光波长355nm，聚焦至1μm光斑，能量设置为45–55μJ，脉冲频率2000Hz。通过显微镜定位目标区域（如海马体亚区），切割面积低至0.1mm²。

蛋白质提取：切割后的组织碎片经冻融循环（-80°C冷冻5分钟，37°C解冻2分钟，重复5次），加入裂解液提取蛋白质，处理后进行质谱分析（Orbitrap Fusion Lumos）。

青莲百奥空间蛋白质组学项目在国内外学术界引起了广泛关注。2022年7月，青莲百奥与中国医学科学院北京协和医院合作，在《Nature Communications》上共同发表了国内首篇关于空间蛋白质组学的研究论文“Spatially resolved proteomic map shows that extracellular matrix regulates epidermal growth”（>>>点击跳转详细解读），为国内空间蛋白质组学的研究树立了新的标杆。

参考文献

[1] Sun Y, Liu D, Liang Y, Yang X, Liu X, Zhao B, Liang Z, Zhang Y, Zhang L. High-Throughput Proteoform Imaging for Revealing Spatial-Resolved Changes in Brain Tissues Associated with Alzheimer's Disease. Adv Sci (Weinh). 2025 Mar 12:e2416722.