2025-01-02 11:04:39 苏州英赛斯智能科技有限公司(Inscinstech Co., Ltd.)
近年来,小核酸药物因其在生化研究和制药领域的广泛应用而备受瞩目。随着固相亚磷酰胺化学法合成寡核苷酸效率的不断提高,偶联效率可达99%。然而这也意味着,在DNA/RNA合成过程中,每增加一个核苷酸单体大约有1%的5''-羟基基团未能与新加入的核苷酸单体发生反应,随着序列长度的增长,最终产物的纯度与产率会逐渐下降。即使是只有20个碱基的寡核苷酸序列,其终产物的理论纯度仅为82%。
在这种情况下,想要得到较高纯度的目标物,则需要增加纯化工艺,如何从含有与其结构相似(如N-1)或其他细微差异(如碱基缺失、骨架不完全硫化等)杂质的粗品中有效地分离出目标物,成为了一个巨大的挑战。特别是当面对更长链的寡核苷酸时,这些杂质的存在使得分离过程变得复杂。
反相色谱:高效分离的关键
反相色谱凭借其卓越的分离能力,在寡核苷酸分析及精制领域发挥着重要作用。通过使用烷基胺乙酸盐作为离子对试剂与寡核苷酸的磷酸盐反离子结合为离子对,增强极性寡核苷酸与反相填料的疏水相互作用,链长越长,疏水相互作用越强,从而实现对样品的有效分离。
反相色谱纯化工艺开发要点
选择合适的制备柱填料
孔径
01
寡核苷酸和核酸的大小和结构各异,从几个碱基到数千个碱基不等,孔径的选择是保证寡核苷酸有效传质进入孔结构的关键。
100Å孔径的填料通常用于较小的寡核苷酸,如反义和siRNA。
300Å孔径的填料具有更高的渗透性和结合容量,适用于75~200个碱基的较大寡核苷酸。
1000Å–4000Å孔径填料则是包括mRNA在内的大型核酸的理想选择,可有效分离全长产物和杂质。
02
粒径
粒径的变化会影响主要寡核苷酸产物的整体分离度和平均保留时间。通常选择粒径范围为3-50µm,在对纯化工艺进行放大时,由半制备柱转移至更大的制备柱时,需要将粒径从较小的填料颗粒(3µm-5µm)调整为制备型填料颗粒(10-50µm),以确保处于制备型仪器的耐压操作范围内,此时可能需要增加色谱柱长度,以增加塔板数(N)使其与小颗粒色谱柱颗粒填料相当。
合适的流速和上样量
03
通常建议的线性流速为150-360cm/h。直径21mm的半制备色谱柱上样量通常在30-300mg,直径50mm的制备型色谱柱上样量可在180-1800mg,如果纯化分离较困难,则需要减少粗品进样量。减少进样量时,首先减少进样体积,然后再降低浓度。
04
流动相选择
反相纯化寡核苷酸时,会在流动相中加入离子对试剂,通常是胺类(三乙胺、三丙胺、己胺、丁胺等),其与阴离子型寡核苷酸相互作用以形成疏水对,再使用乙酸盐作为离子对的反离子。选择的离子对试剂会影响保留时间以及目标寡核苷酸和杂质之间的分离度,当增加离子对的疏水性时,需要使用更高浓度的有机相(常为乙腈)进行洗脱。
梯度优化
05
首先使用分析型色谱柱进行小试方法的摸索,初步优化目标化合物出峰时间及与杂质的分离效果。例如,可使用从2%提高至98%有机溶剂的线性梯度曲线,通过分析型色谱柱的死体积和系统驻留体积之和除以流速,计算出程序设定的溶剂与柱头实际的溶剂之间的偏移时间,从保留时间中扣除偏移时间后得到梯度组成,计算出目标化合物的实际洗脱点后,重新采用较平缓的梯度斜率,通常以实际洗脱点以下15个点开始,提高至计算出的洗脱点以上10个数据点结束,可获得良好的梯度范围。或者,在梯度长度约75%处达到目标化合物的实际洗脱点。
应用实例1
制备柱参数
填料类型:C18;粒径:10 μm;孔径:100 Å;柱长:25 cm;柱直径:2 cm
流动相组成
· 流动相 A:0.1 M 三乙胺醋酸 (TEAA),pH 7.0
· 流动相 B:50% 乙腈 - 50% 水
实验条件
· 样品来源:24mer RNA反义链核酸
· 实验仪器:英赛斯AutoPrep制备型高压液相色谱系统
· 上样量:67mg
· 梯度:T(min) 0 10 20 30 120
B(%) 15 25 35 45 85
纯化图谱结果:
图一:24mer RNA反义链核酸纯化制备图谱
图二:24mer RNA反义链核酸纯化后纯品分析图谱
初始纯度:83.52%
最终纯度:97.34%
收率:63.30%
通过一次反相纯化制备,成功将粗品纯度从83.5%提升至97.3%,同时保持了63.3%的收率。这一过程显著提高了产品的质量,确保了后续应用中的高纯度需求。
应用实例2
填料参数
填料类型:C18;粒径:10 μm;孔径:100 Å;柱长:25 cm;柱直径:5 cm
流动相组成
· 流动相 A:0.1 M 正己胺醋酸 (HAA),pH 7.0
· 流动相 B:50% 乙腈 - 50% 水
实验条件
· 样品来源:16mer DNA核酸
· 实验仪器:英赛斯AutoPrep1000制备型高压液相色谱系统
· 上样量:770mg
· 梯度:T(min) 0 15 165
B(%) 20 40 90
纯化图谱结果:
图三:16mer DNA核酸纯化制备图谱
图四:16mer DNA核酸纯化后纯品分析图谱
初始纯度:73.34%
最终纯度:98.28%
收率:65.91%
经过一次反相纯化制备,粗品纯度从73.34%大幅提升至98.28%,并且实现了65.91%的收率。此案例展示了反相纯化技术在提高寡核苷酸纯度方面的高效性,同时也保证了较高的产物回收率,为后续的研究和应用提供了高质量的原料。样品液后处理可由切向流过滤系统进行脱盐和浓缩,选择合适孔径的膜包,并且确认膜包的耐有机相情况,若膜包不耐受有机相,需要先通过旋蒸将有机相蒸发,或者加水稀释有机相比例,然后通过AutoTFF切向流系统进行浓缩后脱盐。
英赛斯制备液相系统优点
Unqiue AutoPrep制备型高压液相色谱系统
Unqiue AutoPrep1000制备型高压液相色谱系统
Unqiue AutoTFF075自动化切向流过滤系统
01
高纯度和高回收率
· 高载样量:设计了耐高压、流速范围广、精度高的泵系统,可以搭配不同直径的色谱柱,加载更多的样品,从而提高目标化合物的回收率。
· 优化的收集策略:通过精确控制馏分收集,可以最大限度地减少目标化合物的损失,提高整体回收率。
· 高效的分离能力:制备型高压纯化系统搭配耐高压和高效的填料,可以实现复杂混合物中目标化合物的高效分离,确保高纯度的产品。
02
自动化和可重复性
· 自动化操作:实验室制备型高压纯化系统可配备自动进样器、馏分收集器和数据处理软件,可以实现无人值守的操作,提高工作效率。
· 高度可重复性:自动化系统减少了人为误差,确保每次运行的一致性和可重复性。
03
灵活性和多功能性
· 多种分离模式:支持多种分离模式,如反相、正相、复合层析等,可以根据不同的样品需求选择合适的分离方法。
· 可调参数:流动相组成、流速、梯度洗脱程序等参数可以灵活调整,以优化分离效果。
04
耐用性和可靠性
· 高质量组件:使用高质量的泵、阀门和密封件,确保系统的长期稳定运行,减少维护频率。
· 模块化设计:系统采用模块化设计,易于更换和升级组件,延长使用寿命。
在生物制药和化学合成领域,高效、高纯度的化合物分离与纯化是确保产品质量和安全性的关键。英赛斯致力于提供全面的解决方案,满足从实验室研究到大规模生产的各种需求。我们的产品线包括制备型高压纯化系统、工业级高压纯化系统以及切向流过滤系统,为您提供一站式的服务体验。
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