注意这些，让你的RNA建库一路狂飙！

2024-12-12 11:02:34

随着高通量测序技术的发展和普及，转录调控已然成为科研中的常规手段。而文库构建是其中非常关键的一环，建库质量的好坏直接影响到后续数据挖掘的可靠性。为了把主动权牢牢掌握在自己手中，也为了节约成本，越来越多的实验室开始自己进行文库构建。

那么，RNA文库构建难吗？你说它难吗，它真的不难；你说它简单吗，它还是需要我们注意到一些问题的。那到底要注意哪些？

根据研究目的确定RNA文库类型

首先明确物种和RNA类型。原核生物构建原核转录组文库，一定是去核糖体建库。真核生物，根据关注的RNA类型不同选择不同文库。一般情况下，参考下图选择就可以，当然具体问题也要具体分析，我们继续看。

RNA质量如何把控

高质量的核酸是建库成功的基础，一般我们从纯度、浓度、完整性3个方面去评估。

RNA纯度

通过OD260/OD280和OD260/OD230来评估。

RNA浓度

建议采用染料法进行评估，如Qubit等。

RNA完整性

建议采用Agilent 2100进行评估，常规样本的RNA完整性通过RIN值评估，尽量选择RIN值>7的RNA开展后续建库实验，FFPE样本的RNA完整性建议通过DV200进行评估。

那如果不合格怎么办呢？就不能建库了么？

有条件的话当然是重新制备合格样本最好。但如果样本稀有，我们也要充分利用，可以考虑风险建库，甚至风险上机；如果是FFPE样本或者干叶片样本，本身就降解严重无法逆转，那么可以考虑调整文库构建，原本的普通真核转录组文库可以调整为去核糖体文库，从而获得更多的有效序列信息；如果是总量不足，我们还可以通过调整具体细节改成微量建库，等等。总之建库也是一件可以灵活调整的事情，主打一个你有需求我就有方案。

如何选择RNA富集方法

通常抽提到的总RNA（Total RNA）中，绝大部分都是核糖体RNA（Ribosomal RNA，rRNA），mRNA只占总RNA中的一小部分。以人类的细胞或组织为例，mRNA只占2%-3%，核糖体RNA比例则高达95%以上。我们通常说的转录组测序，指的是对mRNA进行测序。在mRNA建库的过程当中，首先要解决就是mRNA富集的问题。

对mRNA进行富集的方法主要包括mRNA富集法/纯化法和rRNA去除法。mRNA富集法/纯化法是直接富集mRNA，通过Oligo dT富集，因此后续数据中只有mRNA。而rRNA去除法是通过去除总RNA中rRNA来达到富集mRNA的目的，后续可以获得除rRNA之外的其他多种RNA分子。需要注意的是，同样是rRNA去除，不同物种有不同的方案哦~

RNA富集策略

选择合适的建库策略

当完成RNA富集后，就要进行RNA建库了。

常规的RNA建库方案都是采用先进行RNA片段化，再进行cDNA合成和后续建库操作，可分为定向RNA建库（链特异性RNA建库）和非定向RNA建库方案。

Small RNA建库方案因为RNA片段较小，无需进行RNA片段化，其建库方案与常规RNA建库方案的操作是有区别的，具体的操作流程可参照实际使用的small RNA建库产品。

circRNA文库构建前一般要先进行RNase R消化线性RNA，再进行RNA文库构建，需要注意的是circRNA建库的RNA Input量较大，需要结合后续的分析需求和测序深度准备足够的RNA。

当然并不是只有lncRNA文库是链特异的，对于自建库来讲，自由度很高的，只要您想得到正负链信息，或者想获得更准确的转录本结构，都可以选择定向文库哦。

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• PCR富集过程中保真度高，不存在碱基偏好性。

成库量比较