聚焦2025版《中国药典》：胶原蛋白的质量研究

2024-09-21 19:57:44, SCIEX SCIEX

胶原蛋白是一种生物高分子物质，是组成人体的重要蛋白质。胶原蛋白是人体内含量最多、分布最广的蛋白质，约占人体蛋白质总量的30%-40%；人体内的胶原蛋白广泛分布于结缔组织中，其中90%存在于皮肤和骨头；胶原蛋白的主要功能是维持皮肤和组织器官的形态和结构，同时也是修复各损伤组织的重要原料物质。

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胶原蛋白的法规在持续的推进过程中，其生产及经营遵循医疗器械监管条例，采用GMP生产标准。2023年1月28日，国家药品监督管理局发布了YY/T1888-2023《重组人源化胶原蛋白》医疗器械行业标准的公告（2023年第14号）。

建立有效的序列分析检测方法可以有助于含胶原蛋白生物制品的质量控制，推荐使用电泳法检测重组胶原蛋白的纯度，而毛细管电泳技术在多个领域均已取代传统电泳法进行蛋白的纯度分析，质谱技术通过分析胶原蛋白的分子量，序列覆盖以及翻译后修饰情况确认胶原蛋白样品的序列，为胶原蛋白的质量控制研究提供数据支撑。

1. 胶原蛋白的分子量，序列和翻译后修饰测定

图1. Trypsin酶切的胶原蛋白样品的序列覆盖分析图

为了确认胶原蛋白序列的覆盖信息及其发生脱酰胺修饰的修饰位点的信息，利用Trypsin和Glu C两种酶分别对样品进行酶切，使用SCIEX X500B QTOF质谱系统在IDA模式下进行数据采集，完成胶原蛋白的肽图测定（图1）。经过Biologics explorer软件计算发生翻译后修饰及未发生翻译后修饰的峰面积，确认脱酰胺修饰的比例约为21.9%（图2），从软件计算得知肽段GPAGPNGIPGEK未发生翻译后修饰的分子量为1092.556，发生翻译后修饰的分子量为1093.54，发生21.9%的脱酰胺修饰会导致该段肽段的实测分子量与未发生翻译后修饰的分子量相比增加约0.21Da。

图2. 肽段GPAGPNGIPGEK未发生翻译后修饰及发生翻译后修饰的XIC图

2. 胶原蛋白纯度测定

CE-SDS方法对胶原蛋白样品的分析见图3。使用碘乙酰胺进行样品非还原处理，图3A中显示，对比空白，共检测到8个峰，其中8号峰为主峰（胶原蛋白），其余均为分子量较小的片段杂质，胶原蛋白的含量为78.77%。考察了方法的重复性，连续运行6针胶原蛋白-NR样品，叠加谱图见图3B。CE-SDS方法下6针样品的迁移时间，校正峰面积百分比的重现性数据见表1。主峰迁移时间 RSD＜0.6%，且第1针和6针主峰的绝对迁移时间仅相差0.17min，校正峰面积百分比 RSD＜0.4%。

图3. CE-SDS方法下对胶原蛋白非还原样品的分析。A.样品分析电泳图，B.6针重复性考察电泳图（n=6）

3. 胶原蛋白等电点测定

将cIEF标准方法的280 nm检测波长改为214 nm进行胶原蛋白等电点的测定，结果见图4，基线的波动来源于214 nm下样品中两性电解质等试剂的背景吸收，但通过与相应的空白对比，仍可定性样品出峰位置，并进行等电点计算。经计算，pI 10.0，9.5，7.0三个Marker具有良好的线性，线性系数r=0.9995，样品峰pI范围为9.77-9.92，主峰pI值9.92，与理论值（9.76）偏差为1.7%。该检测结果具有较高的准确度。