新药筛选也能一键启动？瑞孚迪全自动系统为生命加速！

以“核苷酸-PARP1-HPF1”三元复合物抑制剂筛选为例

ADP-核糖基化酶[Poly (ADP - ribose) polymerase-1 (PARP1) ]是一种在哺乳动物细胞核中高度表达的DNA修复酶。当DNA发生损伤时(如单链和双链DNA断裂，single and double strand DNA breaks，DSB/SSB)，PARP1及同源物PARP2作为DNA损伤的第一响应者，会最先被损伤的DNA招募到损伤位点，以NAD+为原料对组蛋白和其他底物进行单体和多聚核糖基化（PARylation）修饰，然后募集其他DNA修复蛋白到损伤位点共同修复DNA损伤（如图1）。

图1：PARP修复单链断裂DNA示意图 (Cortesi, Rugo et al. 2021)

PARP1在DNA修复中的关键作用，为研发PARP1抑制剂治疗恶性肿瘤提供了理论依据，即合成致死。特别是双链断裂（DSB）修复缺陷的癌细胞，如BRCA1/2突变细胞。基于“合成致死”机理，PARP抑制剂通过与PARP1或PARP2催化位点结合，导致PARP蛋白无法从DNA损伤位点上解离(Dissociation)，束缚在DNA上的PRAP在DNA复制时会导致DNA复制叉停滞，进而导致DNA复制无法顺利进行，正常细胞可以通过同源重组修复机制修复DNA双链损伤，而BRCA缺陷（HR缺陷）的肿瘤细胞则不能及时修复，该DNA断裂便转化为致死性双链断裂，导致肿瘤细胞死亡。所以BRCA1/2突变的细胞对PARP1抑制剂格外敏感。PARP1也成为炙手可热的癌症治疗靶点，已经有多款小分子PARP1抑制剂（PARPi）药物上市，包括奥拉帕利、鲁卡帕利、尼拉帕利、他拉唑帕利、氟唑帕利、帕米帕利等。国内由齐鲁制药开发的奥拉帕利仿制药（齐帕尼®）也已正式开售。

研究表明，DNA损伤特异的PARylation修饰多发生在底物的丝氨酸残基上，这一过程需要HPF1（PARylation Factor1）辅助因子的协助。HPF1可指导PARP1/2以NAD+为原料对底物蛋白质中KS motif中的丝氨酸（Ser）残基进行修饰。HPF1和PARP1/2残基共同形成的酶活性位点对于细胞中DNA损伤诱导的PARylation至关重要(Suskiewicz, Zobel et al. 2020)。因此，有研究者认为抑制剂应靶向PARP1-HPF1，而不仅仅是PARP1 (Rudolph, Roberts et al. 2021)。且鉴于PARP1抑制剂存在的临床问题，如大约40%的BRCA1/2突变癌症患者对PARP1抑制剂具有一定的抗药性(Li, Liu et al. 2020)，那么基于PARP1/2-蛋白复合体的药物研发，相比单独的PPRAi而言更有现实意义。

Kellett等人开发了一种基于PARP1–HPF1复合体的高通量药筛体系进行药物筛选(Kellett, Noor et al. 2023)，其基本原理如图2所示：

图2：荧光标记的核酸-PARP1-HPF1三元复合物药筛模型示意图

筛选用的复合物由一段荧光标记的核苷酸(18mer , 5′ - phosphate -5′ - fluorescein -GGGTTGCGGCCGCTTGGG-3′)，PARP1蛋白和HPF1蛋白构成。当反应体系内存在PARPi或无NAD+时，PARP1&HPF1复合物无法从核酸上解离，从而形成稳定的荧光核苷酸-PARP1-HPF1三元复合物，测定该体系的荧光偏振值时，其数值将偏小；而如果存在有NAD+和PARPi时，则会发生PARyation效应，导致PARP1&HPF1复合物从荧光核苷酸上解离,此时反应体系内存有丰富的荧光小核酸片段，测定该体系的荧光偏振值时，数值将偏大。通过偏振值的大小，即可进行高通药物筛选。

研究人员分辨测试了一个已知的PARP-1 Targeted Library（OTAVAchemicals，包含470个化合物）和一个未知的ChemBridge diversity library（包含10000个化合物），均取得良好的结果。

实验使用瑞孚迪的高通量药筛整合系统完成，主要的设备包括JANUS G3液体处理工作站（瑞孚迪），STX500-DF Deep Freezer -20℃低温冰箱（Drug Library freezer，LiCONiC），Envision 高通量多功能微孔板检测仪（瑞孚迪），FlexDrop iQ纳升加样器（Drug Printer，瑞孚迪），细胞培养箱（LiCONiC），Phenix Plus（瑞孚迪），封膜机（Azenta），Hotel（LiCONiC）等设备组成（如图3）。

图3：全自动高通量筛选系统布局图

化合物存于80% N2低温冰箱中，筛选共使用了32块384孔板完成，每块板包括阳性孔，阴性孔和化合物样本孔。样本孔包含binding buffer24.5μL，PARP1-HPF1-DNA复合物12.5μL，NAD+12.5μL，化合物0.5μL（终浓度20μM）。binding buffer，PARP1-HPF1-DNA复合物，NAD+均使用GANUS G3进行加样，化合物使用FlexDrop iQ加样，体系室温反应15min后，在Envision上进行荧光偏振检测，激发482nm，发射530nm，二向色镜D496。

检测结果，所有孔板的Z’-Factor均值为0.64±0.09，表明该筛选方法建立成功。3SD内的苗头化合物（Hits）有187个（图4）。

图4：Z’和SD数值

使用高通量药筛系统Cherry-picked功能，从化合物源板中自动挑选出这187个化合物，之后使用FlexDrop iQ进行梯度稀释加样，每个化合物作4个浓度梯度（20nM,40nM,80nM,160nM），3复孔做剂量效应反应实验，结果表明166个化合物具有良好的剂量效应反应关系，其中8个代表性的化合物（编号4, 60, 88, 89, 110, 116, 145, 151）剂量效应如图5和表1。

图5：8个代表性化合物剂量效应曲线  

表1：8个代表性化合物IC50

Compound ID

IC50 (μM)

4

1.07

60

7.77

11

13.55

89

13.79

110

20.44

116

22.63

145

36.82

151

40.7

使用JANUS G3工作站将18000个SUM149PT细胞系接种于96孔PhenoPlate中（瑞孚迪），之后通过机械臂移动至自动培养中过夜培养，并进行换液，染色，然后使用Phenix Plus高内涵成像系统拍照，对筛选出的8个代表性苗头化合物（两个浓度梯度，10，12,5μM）进行PARylation功能验证，结果表明4, 88, 145三个化合物对PARylation效应具有明显的浓度梯度效应，其中化合物4的效果最为明显（图6）。进一步使用类器官模型验证化合物4的药物毒性（CellTiter Glo3D，Envision化学发光检测），结果表明其具有明显的浓度梯度杀伤效应，IC50为251μM（图7）。

图6：PARylation验证（抗体荧光染色）

图7：类器官药物毒性验证

该研究项目中，研究者使用瑞孚迪的高通量药筛整合系统，开发了一种新的居于荧光标记的核苷酸-PARP1–HPF1三元复合物的药筛模型，对10000种化合物进行筛选，得到187个3SD内的Hits。系统整合了大量瑞孚迪的设备和仪器，包括中控软件，机械臂，JANUS G3液体处理工作站，Envsion高通量多功能检测仪，Flexdrop iQ纳升移液器等，可以对药物进行全自动溶解，存储，加样，Hits挑选，梯度稀释，细胞铺板，细胞培养与换液，高内涵成像检测，活性评估等，系统功能强大，自动化程度高，重复性好，是药物筛选的强大利器。作为全球药筛的领跑者，瑞孚迪还具有丰富的药筛耗材和试剂，可为药筛客户提供全面的解决方案。

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Opera Phenix® Plus高内涵成像系统

EnVision® Nexus™多模式检测仪

JANUS® G3 液体处理工作站

FlexDrop™Plus 纳升加样器 

参考文献

1. Cortesi, L., H. S. Rugo and C. Jackisch (2021). "An overview of PARP inhibitors for the treatment of breast cancer." Targeted oncology 16(3): 255-282.

2. Kellett, T., R. Noor, Q. Zhou, H. Esquer, R. Sala, P. Stojanovic, J. Rudolph, K. Luger and D. V. LaBarbera (2023). "HTS discovery of PARP1-HPF1 complex inhibitors in cancer." SLAS Discovery 28(8): 394-401.

3. Li, H., Z. Liu, N. Wu, Y. Chen, Q. Cheng and J. Wang (2020). "PARP inhibitor resistance: the underlying mechanisms and clinical implications." Molecular Cancer 19.

4. Rudolph, J., G. Roberts and K. Luger (2021). "Histone Parylation factor 1 contributes to the inhibition of PARP1 by cancer drugs." Nature Communications 12.

5. Suskiewicz, M. J., F. Zobel, T. E. H. Ogden, P. Fontana, A. Ariza, J.-C. Yang, K. Zhu, L. Bracken, W. J. Hawthorne, D. Ahel, D. Neuhaus and I. Ahel (2020). "HPF1 completes the PARP active site for DNA damage-induced ADP-ribosylation." Nature 579: 598 - 602.