荧光滤光片与荧光显微镜简介

2024-05-08 11:17:06, 韵翔光电 江阴韵翔光电技术有限公司


用于荧光显微镜的滤光片设计的主要目标是创建最大化图像对比度并保持图像质量的滤波器组。了解荧光滤光片如何在越来越多的利用新技术的应用中发挥作用,例如用于照明和样品操作的激光、数字图像处理、计算机辅助定位和控制以及超灵敏检测设备。

荧光滤光片类型

01

典型滤光片装置概述

落射荧光显微镜中的主要滤光元件是安装在荧光滤光立方体(或滤光块)中的一组三个滤光片:激发滤光片、发射滤光片和二向色分束器。

“理想”荧光组,包括覆盖在示例吸收(激发)和发射光谱上的激发器、二色性和发射器。

激发滤光片(也称为激发器)仅透射有效激发特定染料的那些波长的照明光。尽管过去使用短通滤光片设计,但现在几乎只使用带通滤光片设计。发射滤光片(又名屏障滤光片或发射器)衰减激发滤光片透射的所有光,并非常有效地透射标本发射的任何荧光。该光总是具有比激发颜色更长的波长(更接近红色)。这些滤光片可以是带通滤光片或长通滤光片。二向色分光镜(又名二向色镜或二向色分光镜)是一块与显微镜光路成45度角的薄镀膜玻璃。该涂层具有反射一种颜色(激发光)但透射另一种颜色(发射的荧光)的独特能力。当前的二向色分束器以很高的效率实现了这一点,即具有大于90%的激发反射率以及大约90%的发射透射率。这比传统的灰色半镀银镜有了很大的改进,传统的半镀银镜只反射50%,只透射50%,效率只有25%左右。

特定荧光染料的光谱特征可以与荧光滤光片组的光谱轮廓重叠,以帮助选择用于任何给定应用的最合适的滤光片组。图7说明了对于给定的荧光激发和发射光谱,“理想”滤光片组的光谱轮廓可能是什么样子。正如你所看到的,激发滤光片透射跨越吸收光谱的光,而发射滤光片透射跨越荧光染料峰值发射的波长带。二向色性使激发光衰减,并且仅透射来自发射的光。

典型滤光片立方体的示意图

一旦根据具体情况选择了单独的激发器、发射器和分色镜,它们就被安装在滤光立方体中,并准备在显微镜中使用。用于倒置显微镜的典型滤光立方体的示意图如上图8所示。大多数显微镜都有一个滑块或转台,可以容纳两到四个单独的滤光立方体。必须注意的是,每个立方体中的滤光片是一个匹配的集合,除非已知每个滤光片组件的完整光谱特性,否则应避免混合滤光片和分束器。

常见的滤光块以激发滤光片的类型命名:UV或U(DAPI和Hoechst 33342等染料的紫外激发)、B(FITC和相关染料的蓝色激发)和G(TRITC、Texas Red®等的绿色激发)。常见的屏障滤光片颜色在U块中为蓝色或浅黄色,在B块中为绿色或深黄色,在G块中为橙色或红色。

02

多波段滤光片组

多个荧光染料的使用以前受到需要在每个单色图像之间切换滤光立方体所产生的问题的限制。“像素偏移”(由各个滤光片组之间的光学不一致引起,将在显微镜部分的图像采集页面上进一步讨论)导致数字组合图像中的伪影。此外,切换立方体所需的时间阻碍了活细胞的高速成像,并且对使用多种荧光染料对样本进行成像的新方法的需求越来越大。结果,多波段滤光片组很快被引入,并且出现了三种不同的滤光片配置,每一种都允许在同一样品中同时/顺序成像多种荧光染料。

一种滤光片配置是包括多频带激发器、多频带二色性和多频带发射滤光片的组。这种配置被称为“全多波段”。全多波段组的概念可以创建每个滤光片来选择性地传输和阻挡多个波段的波长。该配置要求用户使用彩色CCD照相机,并用单个图像同时捕获样品中存在的多个荧光染料。然而,这种能力伴随着不能使用单色CCD的代价,并且由于激发和发射光谱之间的渗透而降低了单个荧光染料信号的光学分离。下面显示了一个完整的多波段集合的示例频谱,其中相应的滤光片在立方体示意图中进行了颜色编码。

为染料DAPI、FITC和Texas Red®设计的三波段滤光片组的光谱,带有颜色编码的立方体示意图

被称为“SEDAT ”和“Pinkel ”的其他配置都结合了多波段二向色性,但在所使用的激发和发射滤光片的组合上有所不同。SEDAT滤光片配置使用单频带激励器和单频带发射器,而Pinkel配置使用单频带激励滤波器和多频带发射器。尽管在比较多频带滤波器组时,SEDAT配置在大多数情况下会给出最高的信噪比,但使用平克尔组时获得的信噪比可能高于使用全多频带配置时获得的信噪比。在下图中,当使用任何多波段滤光片组时,通常使用单色相机来单独捕获来自每个荧光染料(在这种情况下有三个)的发射,以数字方式应用假彩色,并将它们叠加以获得最终图像。

使用单色相机和数字处理创建多波段图像的步骤

在荧光显微镜中还可以发现其他光学滤光片:1)热滤光片,也称为热镜,被结合到大多数显微镜的照明器收集器光学器件中。它衰减红外光(通常波长大于800nm),但透射大部分可见光。2)中性密度滤光片,通常安装在聚光器和孔径光阑之间的滤光片滑块或滤光轮中,用于控制照明强度。3)有时安装用于荧光以外的技术的滤光片,例如用于透射光显微镜的彩色滤光片和用于偏振光显微镜的线性偏振滤光片。

命名法和惯例

激发滤光片(例如ET480/40X)-在本例中,中心波长为480nm,全带宽为40nm[=+/-20nm]。在未指定带宽的某些情况下,字母“ X ”用于将滤光片定义为激发滤光片。这通常用于窄带UV激发滤光片,即ET340X。

二向色分束器(T495LPXR)-对于该二向色长通镜,透射率约为50%的截止波长为495nm。

发射滤光片(ET535/50M)-此处的中心波长为535nm,全带宽为50nm[=+/-25nm]。

T-磁控溅射二色性/多色性,通常为45度Aoi

ET-磁控溅射激发器或发射器,通常垂直入射(最大性能)

Z-专为激光使用而设计的产品

ZT-专为激光使用而设计的磁控溅射二色性/多色性,通常为11-45度Aoi

ZET-专为激光使用而设计的磁控溅射激发器或发射器

D-垂直入射的非溅射激发器或发射器(基本性能)

HQ-用于垂直入射的非溅射激发器或发射器(增强性能)

Q-非溅射二色性/多色性,通常为45度Aoi

LP-表示长通滤光片或分色镜,其分别透射比截止波长更长的波长并阻挡或反射较短的波长

SP-表示短通滤光片或分色镜,其分别透射比截止波长短的波长,并阻挡或反射较长的波长

DC-“二向色”的简写,通常为45度Aoi

XR-扩展反射,通常为45度Aoi

XRU-包括UV的扩展反射,通常为45度Aoi

PC-多色分束器。这是一种反射和透射两个以上光带(通常为45°Aoi)的分束器

绿色玻璃。来自肖特玻璃厂(Schott Glassworks)的Longpass吸收玻璃,在紫色和蓝绿色区域具有截止波长

OG-橙色玻璃。来自Schott Glassworks的Longpass吸收玻璃,在绿色、黄色和橙色区域具有截止波长

RG-红色玻璃。来自肖特玻璃厂(Schott Glassworks)的Longpass吸收玻璃,在红光和远红光区域具有截止波长

X-激发滤光片

BS-分束器

M-发射滤光片

滤光片特性

滤光片以其透射和阻挡不同波长范围的光的能力来表征和命名。本节讨论不同类型滤光片的频谱轮廓,并重点介绍其特性如何将它们彼此区分开来。

01

带通滤光片

带通滤光片被设计成透射特定范围的波长并阻挡该范围任一侧的光。这些滤光片由它们的中心波长和带宽表示。中心波长(CWL)是峰值透射率的50%处的波长的算术平均值。半峰全宽(FWHM)是峰值传输的50%处的带宽。

02

长通滤光器和短通滤光片(LP SP)

LP和SP滤光片由其在峰值透射率的50%处的截止或截止波长表示。LP或SP滤光片具有非常陡峭的斜率,通常称为边缘滤光片。平均透射率是在滤光片的有用透射区域上计算的,而不是在整个频谱上计算的。

传输特性术语

03

中性密度滤光片

中性密度(ND)滤光片通常称为灰色滤光片,它均匀地阻挡所有波长的光。例如,一个特定的ND滤光片可能透射整个可见光谱的2%,而另一个可能透射相同范围内的50%的光。ND滤光片通常用于特定范围,并且在该范围的两端都会下降,因此在订购时指定您的应用非常重要。

22000a中性密度滤光片组

04

干涉滤光片

技术上称为干涉滤光片,这些滤光片是通过在由不同类型的玻璃或熔融石英组成的基底上施加微观上薄的材料层而制成的。层数或腔数决定了该特定滤光片的带通形状。FWHM处的带通宽度随着腔数的增加而增加,并且随着截止或截止的斜率而增加。斜率是滤光片能够以多快的速度从滤光片的阻塞区过渡到透射区(反之亦然)的量度。下面讨论几种滤光片类型之间的带通形状的差异:

D/HQ/ET

D型和HQ型滤波片之间的主要区别是带通阻塞截止和截止的斜率。D滤光片的截止和截止斜率较小,而HQ滤光片的斜率较大。换句话说,在HQ设计中,从低阻塞到高阻塞所需的频谱更少。这允许我们加宽HQ滤光片的带通,同时在“光谱空间”中将激发和发射带通移动得更近。ET滤光片具有与HQ滤光片相似的阻塞特性,但ET滤光片在带通上的平均透射率为95-98%。需要注意的是,%t和阻塞之间没有依赖关系。部分由于滤光片的吸收性,不可能从透射曲线中解释阻挡水平或陡度。这就是为什么在表示特定滤光片的频谱特性时,同时显示%T和OD图的原因。

A)

B)

D、HQ和ET型滤光片之间的差异。A)D480/40x、HQ480/40x、ET480/40X的典型传输,B)相同的典型带外阻塞。注意A)中ET480/40x的平均带通传输较高,而B)中阻塞能力的斜率较小

荧光显微术

现代荧光显微镜的构造经历了近100年的发展。照明、光源和成像技术的巨大进步使工作人员能够以前所未有的精确度观察标本。本节解释了其中的一些技术以及如何使用它们。

荧光显微镜

目前最常见的荧光装置是落射荧光显微镜,因其使用反射光照射样品的方式而得名。通过这种配置(如下所示),荧光滤光片只需要滤除从样品散射回来或从玻璃表面反射回来的激发光,而不是直接的激发光。使用高质量的油浸物镜(由具有最小自发荧光的材料制成并使用低荧光油)消除了这些表面反射中的一些,这可以将反向散射光的水平降低到入射光的1/100。此外,将激发光反射到物镜中的二向色分束器将反向散射的激发光过滤掉10到500倍。使用油浸法的落射荧光显微镜,除了良好的二向色分束器外,不使用任何滤光片,可以将可观察到的激发光相对于观察到的荧光的数量减少到1(对于非常明亮的荧光)到105或106(对于非常微弱的荧光)的水平。如果想要获得荧光图像的十分之一的背景,则需要系统中的附加滤光片来将观察到的激发光减少106或107(对于弱荧光样本),并且仍然透射几乎所有可用的荧光信号。幸运的是,有一些可用的滤光片技术能够满足这些严格的要求。

宽视野落射荧光显微镜的示意图,显示了用于照射标本和对标本成像的独立光路

这种配置在20世纪60年代后开始商业化,但在这一历史时期之前和之后,还有其他重要的技术进步促进了荧光显微镜的发展。几个例子包括:

1.紧凑型汞灯和氙弧灯的发展(1935年);

2.彩色滤光玻璃制造的进步,使得能够使用由可见光有效激发的荧光染料(因此允许例如使用简单的钨丝光源);

3.显微物镜设计与应用的进展;

4.用于显微镜光学的抗反射涂层的介绍(约1940年)。

最近的技术发展使荧光显微镜能够跟上多年来生物和生物医学科学的显著进步。其中包括超灵敏照相机、激光照明、共焦和多光子显微镜、数字图像处理、新型荧光染料和荧光探针,当然还有光学滤光片和分束器的巨大改进。

光源

汞弧灯的光谱(未显示300nm以下的中紫外输出)

荧光显微镜最常用的光源是汞弧灯,因其在紫外和可见光谱中的高亮度(技术上称为亮度或辐射度)而被选择。该光源的光谱(图20)在几个集中的窄带(称为线)中输出其大部分光,每条线的宽度约为10 nm。方便的是,大多数通用滤光片组具有传输这些线路中的一条或多条的激励滤光片。

氙弧灯的光谱

荧光显微镜中使用的另一种光源是氙弧灯,其在可见光范围内具有相对连续的输出光谱。在对染料和/或样品的光谱特性进行定量分析的系统中,氙弧灯是首选,但其亮度不如同等瓦数的汞灯。即使在汞灯相对较弱的FITC激发区域(在450和500nm之间),氙弧灯也仅略微更亮。这主要是由于氙灯的光产生弧的大小大约是等效汞灯中的弧的两倍,这减少了使用典型的显微镜配置可以聚焦到样品上的可用光量。

氩离子激光器的典型光谱(数据来自光谱物理激光公司)

对于那些使用某些类型的荧光显微镜的人来说,激光光源已经成为越来越普遍的选择,关于这一点,在我们的激光应用笔记中有更多的描述,由Michael Stanley博士撰写。由滤光片产生的输出光谱由于其相干性而被限制在较小的波长范围内。这意味着激发滤光片的阻挡范围仅需要覆盖激光器的输出范围。例如,氩离子激光器不需要IR阻挡。

图像采集

在任何显微镜设置(荧光或明场)中,必须仔细选择所使用的光学探测器,以便为应用提供最高质量的图像。这种选择通常不是微不足道的,因为研究人员必须考虑无数的变量,其中大多数是相互排斥的。很多时候,一个变量被优化,而其他变量则受到负面影响。因此,在大多数活细胞显微镜情况下,主要任务变成平衡细胞的健康与图像的质量,考虑诸如细胞活力、信噪比和所需的分辨率或采集速度等因素。特定调查的目的和目标应确定这些因素的优先顺序。

检测器选择包括用于捕获明场图像或含有多种荧光染料的样品的彩色CCD相机、常用于DIC模式成像的红外敏感相机、用于捕获低水平荧光信号的电子倍增CCD相机、用于TIRF和其他特定荧光技术的高分辨率单色传感器等。

像素移位和多带滤光片组

当在标准显微镜中使用单独的滤光立方体制作用几种荧光染料染色的标本的多次曝光照片或多个电子图像时,在曝光之间将不可避免地存在配准偏移。发射滤光片和分束器中楔形量的变化、分束器的厚度和对准的变化以及当立方体被切换时发生的机械振动都有助于这种偏移。尽管对于某些应用,这些效应可以降低到可接受的水平,但许多其他应用需要更复杂的滤光片设计和光学设备。

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