单颗粒spICP-TOF：精确定量与人体细胞关联纳米塑料颗粒

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2023.12.13

TOFWERK

TOFWERK icpTOF

      纳米塑料被认为广泛存在于环境、食物和空气中，可能对人类健康构成潜在危险，检测单细胞中的纳米塑料对了解其毒性机制和潜在危害至关重要。为此，瑞士苏黎世联邦理工Denise Mitrano教授课题组开发了一种单细胞电感耦合等离子体飞行时间质谱法（sc-ICP-TOF），用于灵敏地、快速量化与细胞有相互作用关系的纳米塑料。了解纳米塑料与细胞，尤其单细胞层面上，的关联关系是评估纳米塑料与细胞异质性互相作用的有效途径。这是以高通量方式了解纳米塑料与细胞相互作用多样性的第一步，不仅可以应用于人类细胞，还可以用于其他细胞和生物系统。

      不同大小尺寸的塑料污染（大型塑料、微型塑料和纳米塑料）的物理和化学特性会导致它们不同的归宿和环境/生理危害。当塑料颗粒变小时，许多不同过程会影响其环境风险，包括与生物的相互作用或更重要其对生物的不利影响。目前几乎没有证据表明，微米级别的颗粒可以穿过生物屏障，如肺部或肠道内壁，因此，大部分微粒预计会被原样排出体外。不过，科学家们已经在人体组织中观察到了一些微塑料。尤其尺寸低于400纳米时，微粒的生物学命运就会发生变化，塑料微粒可能进入细胞，跨越生物屏障，被人体吸收。研究人员利用不同细胞对几种聚合物纳米材料的吸收和影响进行了系统性研究，结果表明这些塑料颗粒的细胞吸收和其它材质的纳米颗粒相当。纳米塑料的粒径和外表面化学性质在颗粒的转运和吸收过程中都起着至关重要的作用。此外，细胞多样性也能驱动不同的颗粒摄取机制，如40nm羧基化聚苯乙烯在J774A.1巨噬细胞中显示出独特的进入途径（大胞饮、吞噬和凝集素介导的内吞）；A549肺泡上皮细胞（小窝蛋白和凝集素介导的内吞）。一般而言，各种细胞都有不同的摄取机制，但由于现有大多数研究使用的都是原生聚苯乙烯纳米塑料，因此研究人员需要进一步研究以了解不同塑料颗粒聚合物类型或次生纳米塑料在吸收途径上可能存在的差异。

      研究微粒与细胞之间的生物相互作用并不是一个新的研究领域，因此，可以借鉴纳米医学和工程纳米材料的纳米毒理学从而了解纳米塑料如何与细胞结合。这两个领域的纳米安全都着重于开发了解纳米材料和细胞相互作用的方法。研究人员致力于研究复杂混合物以及生物体和细胞模型中颗粒的表征技术，此外，他们还研究纳米材料的物理化学特性在暴露过程中相互产生的化学和生物效应，这些效应包括生物分布、生物转化、生物富集和生理毒性。这些概念和方法同样适用于纳米塑料。

      与其他金属基纳米材料相比，评估纳米塑料与细胞的相互作用在分析化学层面更具挑战性。微米级的塑料微粒可通过传统ICP-MS分析来检测含碳量。然而，ICP-MS对碳元素的灵敏度较低，因此不能够检测纳米级粒径塑料颗粒。以前曾用标记或掺杂（荧光染料、同位素标签或痕量金属）的纳米塑料来跟踪和表征复杂介质和生物组织中的纳米塑料。荧光标记是一种常用方法，它可以通过简单的光学方法进行检测，但也有其局限性：加入的染料可能改变颗粒特性和生物相互作用，荧光缺乏稳定性，染料从微粒中泄漏影响检测灵敏度，以及检测和量化单个或小微粒灵敏度有限。使用掺杂金属的纳米塑料与其他方法相比，有几个关键优势。有现有的痕量金属分析的标准方法可循，可用于测量各种技术和环境体系（包括生物组织和细胞）中的金属掺杂塑料。样品检测方法通常是先通过微波诱导酸消化样品基质，并用ICP-MS分析金属含量，再反推特定样本中的总塑料颗粒浓度，来评估颗粒的归宿和迁移或颗粒在生物体内的吸收和沉积。但是这种批量分析无法检测单细胞内部的吸收情况，或评估单细胞互相作用纳米塑料物数量。

     如将ICP-MS对无酸解处理的样品上进行测量，例如使用单颗粒ICP-MS（sp-ICP-MS）或单细胞ICP-MS（sc-ICP-MS），研究人员就可以评估与单个纳米颗粒或单个细胞互相作用的纳米颗粒。这两种情况都是在单个实体的基础上快速分析样品，但是单细胞或单颗粒ICP-MS的区别在于分析的样品和样品导入系统的不同。液态样品雾化后，单个实体（纳米颗粒和/或细胞）以液滴的形式被带入等离子体中，随后在电感耦合等离子体中被气化、雾化并最终被电离。每单个实体都会产生离子云，并以高于背景的尖峰形式被记录下来。检测到的尖峰频率与单个实体的数量浓度成正比，而尖峰信号的大小与单个实体的数量浓度成正比。这种方法通常使用的是四级杆ICP-MS，因此在单实体的瞬间事件中只能记录一种元素（或使用快速单颗粒ICP记录两种元素）。另一种方法是使用ICP飞行时间质谱仪（ICP-TOF），则可同时获得每个单一实体瞬时时间的全元素质谱信号，从而确定单个颗粒、细胞或聚集体的广谱元素指纹。通过这种方式检测掺金属的纳米塑料与单个细胞的互相作用，可提供比其他方法更高的颗粒与细胞作用的细致分析。

   值得注意的是，早在十多年前，Bandura等人就为sc-ICP-TOF奠定了基础。他提出了对单细胞进行高时间分辨率分析的概念，从而为流式质谱分析法铺平了道路。流式质谱仪，又称CyTOF，是一种专门ICP-MS，配有专门的飞行时间质谱检测器，专门用于单细胞分析。由于该技术无法检测到单细胞中的大多数原生元素（比如质量数小于75 amu的元素），因此需要使用金属同位素标签来标记细胞，并根据这些金属标签信号来检测细胞。这种方法的技术进步为这一领域带来了巨大更新，实现了对微米级单细胞的高通量分析。然而，当需要研究金属组学时，金属组学包括生物系统中存在的常量金属、微量金属和类金属，以及它们在各种生物过程中的作用，流式质谱仪在检测低质量元素方面的局限性也就显而易见了。为了检测内源性细胞元素，可以同时检测m/z 7-280广谱元素信息的ICP-TOF优势明显。

     本研究中，研究组采用sc-ICP-TOF方法来评估纳米塑料与培养的人体细胞之间的相互作用，以证明该技术的原理，并比较两种最相关的细胞类型（即单核细胞/巨噬细胞和上皮细胞）对生物屏障上的纳米塑料互相作用或吸收的情况。本研究的重点是肺细胞，因为除了摄入和皮肤接触外，肺部吸入是纳米塑料吸收的主要接触途径之一，且肺部对纳米颗粒接触特别敏感。此外，研究人员还对单核细胞/巨噬细胞进行了研究，因为它们是先天性免疫系统的第一道防线，它们会立即与纳米颗粒发生反应，引发各种免疫反应。研究使用掺杂金属的纳米塑料使研究人员通过利用ICP-TOF将纳米塑料颗粒事件与细胞事件进行充分匹配。更具体地说，研究人员的目标是1）优化样品制备和样品导入系统，实现高颗粒和高细胞回收率，2）展示sc-ICP-TOF检测单个纳米塑料和单个细胞的实用性，3）了解人类单核细胞（THP-1）和肺泡上皮细胞（A549）与模型纳米颗粒剂量之依赖性。总之，这项工作为采用强大的分析方法探索单细胞水平的纳米塑料奠定了坚实的基础。

3.1 模型纳米塑料的合成和表征

掺杂钯（Pd）的纳米塑料由Mitrano等人在实验室合成。纳米塑料使通过乳液聚合法制造的，将盐和引发剂一起引入含丙烯腈和SDS的反应器中，形成纳米塑料，金属含量约为0.3wt%。随后在核心颗粒上生长出一层聚丙乙烯外壳，使其最终直径达到200纳米。研究人员将掺杂Pd的纳米塑料进行了粒度、表面电荷和金属含量的表征。颗粒的流体力学直径分别通过动态光散射（DLS）和zeta电位（Malven Zetasizer）测定。以往的研究测试了纳米塑料掺入钯示踪剂的稳定性，确保暴露实验期间不会发生泄漏。

3.2细胞培养制备和纳米塑料暴露

本研究使用人类肺泡上皮细胞系A549和人类急性单核细胞白血病THP-1进行纳米塑料-细胞互相作用的研究。细胞在RPMI-1640培养基中培养，辅以10%胎牛血清、0.2mg/mL谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素。粒子储备液使用时稀释至所需浓度。在进行暴露研究时，首先将细胞接种在T75烧瓶中，培养4小时，然后加入相同体积含双倍浓缩颗粒的培养基（即0、1、10和100μg/L纳米塑料），使最终纳米塑料浓度分别为0.、0.5、5和50μg/L。两种细胞进行相同的处理，并进行了三次重复。暴露24小时后，直接收集THP-1悬浮细胞，而粘附的A549细胞则先用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次，以去除未结合的颗粒，然后进行胰蛋白酶切。为了去除未结合的纳米塑料，细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，然后用4%的多聚甲醛固定10分钟，再用超纯水冲洗两次。细胞需要保存在4℃。在进行sc-ICP-TOF分析前，需要在此用超纯水洗涤细胞，并稀释10倍，达到分析所需的适当颗粒浓度（第5.3节）。

3.3 单细胞模式下的ICP-TOF程序

本文中所有检测均使用ICP-TOF仪器（icpTOF S2，瑞士TOFWERK AG）。icpTOF的数据采集频率为83.3kHz，并以连续模式收集全元素谱图（m/z 7-280）。仪器配备了陷波滤波器，可以在进入TOF腔前选择性地衰减高丰度元素信号，如等离子气体离子（N₂⁺，H₂O⁺，O₂⁺，Ar⁺）以及基质离子（Na⁺），从而保护TOF检测器。细胞悬浮液通过单细胞样品导入系统进入系统和一个手动的10μL/min流速的注射器。这种专用的样品导入系统有低流量的气动雾化器和（MicroMist HE U系列雾化器0.2ml/min）和总消耗量喷雾室组成。在该系统中，使用防护套可以防止样品沉积并提高传输效率。研究人员使用稀释的金纳米颗粒（50.1nm±1.8nm，原始PNC 3.9x1010）通过颗粒频率法来评估雾化效果。系统的雾化效率为83±3%。仪器在碰撞池模式下运行，使用5mL/min的预混合气体（He+7%H2）来消除ArO+对56Fe+的干扰。（详细的操作条件列表参见原文表S1。）每个样本至少检测了超过1000个细胞。

采集数据后，研究人员用TOFpilot（V2.10，TOFWERK AG）中的LiquidReprocessing模块处理数据，包括处理数据阈值，即识别离散事件，如细胞、纳米塑料或与信号基线相关的事件，然后进行事件校正和去除基线。这些步骤能将数据集细化为目标分析物，选择目标细胞核素（24Mg，31P，56Fe，64Zn，65Cu以及Pd同位素104Pd，105Pd，106Pd，108Pd和105Pd关联的纳米塑料事件），然后以CSV格式导出，进行下一步自编脚本R统计数据分析。从细胞培养到分析和数据软件的实验设计概览见图1.

图1 实验设计概述。在细胞培养、暴露于模型掺杂钯的纳米塑料和清洗（步骤1）之后，不同的细胞样品通过专用的单细胞导入系统导入ICP（步骤2）。使用ICP-TOF，该设备可以在高灵敏度和高时间分辨率条件下进行广谱质量分析，检测每个粒子在毫秒时间内多元素指纹，然后将其在数据处理过程中归纳为不同分类情况，即细胞、纳米塑料或细胞+纳米塑料事件（步骤3）

4.1 利用sp-ICP-TOF表征纳米塑料

将细胞暴露于模型掺杂钯的纳米塑料之前，首先必须评估单颗粒模式下的检测掺杂钯的纳米塑料的可行性，并简化纳米塑料事件的数据。研究人员用稀释的纳米塑料悬浮液（每毫升约1x 10⁵个颗粒），高于基线的峰值被识别为单个纳米塑料，对应纳米塑料的数量（图2a）。在单颗粒事件中所有钯同位素均与天然钯的同位素丰度比例相符（图2a，插入部分）。由于¹⁰⁶Pd和¹⁰⁸Pd是钯两种最丰富的同位素，因此它们在接下来的数据分析中用作纳米塑料的照主要识别标记。每种纳米塑料颗粒的脉冲强度不同，可能是因为每个颗粒的钯载量略有差异或颗粒在稀释过程中发生团聚。从检测到的超过18000个纳米塑料脉冲信号来看，强度范围从10到＞500计数，从信号强度直方图（图2b）中可以评估每个颗粒的平均钯载量。在此，研究人员采用对数正态拟合，得出平均信号强度为32±7计数。虽然拟合结果与数据并不理想，与对数正态分布有一些偏差，但大多数纳米塑料的中心信号强度约为32个计数，因此每个颗粒的钯信号强度足以检测到这些模型纳米塑料，而且应该可以通过每个颗粒度平均信号强度除以与每个细胞相关的总信号强度，就能评估出每个细胞中纳米塑料的数量。

     原文图2 a）在超纯水中稀释掺杂钯的纳米塑料模型，通过sp-ICP-TOF分析，基线以上的峰值与单个纳米塑料相对应。插入图，纳米塑料中钯同位素丰度与自然界钯丰度一致，其中钯分布在六种稳定同位素中，¹⁰²Pd（1.02%）、¹⁰⁴Pd（11.14%）、¹⁰⁵Pd（22.33%）、¹⁰⁶Pd（27.33%）、¹⁰⁸Pd（26.46%）和¹¹⁰Pd（11.72%）。因为¹⁰⁶Pd和¹⁰⁸Pd是两种最丰富的同位素，在随后的实验中将它们作为识别钯纳米塑料的标记。b）¹⁰⁶Pd在整个纳米塑料中钯载荷的强度频率分布，数据采用对数正态分布拟合，得出每个纳米塑料事件的平均值为32±7个计数

3.2 用于单细胞分析的样品导入系统的方法开发和性能

研究人员对单细胞样品导入系统进行了微调，以确保细胞进入等离子体时的完整性（即降低细胞破裂）。由于雾化器顶端的背压，雾化器的高流速可能会导致细胞破裂，从而增加细胞碎片以及细胞元素离子背景的升高，因此需要优化气体流量。优化标准设定为时间计数而不是信号强度（详见原文表S1）。

由于本研究中的两种细胞比100nm的金纳米粒子大得多，因此需要根据细胞的初始浓度重新评估雾化效率。THP-1细胞的雾化效率介于14%-33%之间，A549细胞的雾化效率介于2%和6%之间。以前的文献报道的细菌雾化效率大于70%。不过需要注意的是，人体细胞（直径10-20μm）通常比细菌细胞（直径1-5μm）大，因此雾化效率会降低，这与之前发表的研究结果一致，细胞大小与雾化效率之间存在负相关关系。虽然这些结果表明，在未来的研究中，应使用类似的尺寸标准来准确评估传输雾化效果，但就目前而言，目前仍缺乏使用细胞分析的特征明确的微米大小标准。此外，随着人们对单细胞ICP-TOF的研究深入，不同的专用系统可以进一步提高细胞的雾化效率。例如Menero-Valdes等人使用商业化的MicroFAST单细胞进样装置，并报告称铂纳米颗粒的雾化效率为81%，ARPE细胞的雾化效率为51%。在另一项研究中，上述自动进样器的稳健性和可重复性在纳米颗粒分析中得到了验证，为高通量单细胞分析带来了巨大前景。

3.3 利用sc-ICP-TOF基于元素指纹检测THP-1和A549细胞

流式质谱法是根据重金属结合的探针或抗体识别细胞特定的胞内或胞外靶标或抗原，从而识别细胞。与流式质谱法不同，ICP-TOF质谱法根据细胞的原生元素组成来检测细胞，它可以检测每单个细胞的全质谱谱图，而无需事先了解细胞中存在的元素，因此可以更好确定细胞的内源元素指纹。在此分析的细胞中，Mg、Fe、P、Cu和Zn都能检测到，因此被确定为潜在的细胞指纹元素。Mg是一种重要的矿物质，参与DNA和RNA合成以及能量代谢和离子运输。P是核酸、磷脂和载能分子（如ATP）的基本成分，使其成为活细胞的重要组成部分。Fe是血红蛋白（运输氧气）中血红素的关键成分，并参与氧化还原反应。Cu是参与细胞新陈代谢的酶的辅助因子。Zn参与各种细胞过程，如DNA修复、基因表达和免疫功能。但由于细胞大小和含量差异，以及特定元素的仪器灵敏度和检测极限不同，它们的检测结果并不一致。虽然在许多细胞中都观察到了Mg和Fe，但在一些细胞中Mg的含量变化很大，Mg含量在一些样本中的高变异性阻碍了将其用作可靠的细胞标记物。此外，仪器检测铁的灵敏度不够，在较小的细胞中，铁的检测出受到限制，导致结果不一致。因此，研究组将上述五个元素都定义为细胞事件的“必备条件”。因为有些细胞的信号可能低于某些元素的检测阈值，从而导致假阴性，因此细胞事件总数会有所减少。为了解决这个问题，研究人员在数据分析过程中改进了细胞选择标准，并得出结论，将³¹P和⁶⁴Zn信号同时记录，作为最可靠的细胞事件指示，与细胞大小无关。这种方法降低了假阴性的风险，并有助于准确地将细胞事件和记录事件准确对应。

3.4 单细胞分析纳米塑料在人体细胞的吸收和相互作用

与流式质谱法不同，本研究开发的方法侧重于通过ICP-TOF对单细胞进行直接、无标记的原位分析，同时还能检测纳米塑料中的钯的吸收情况。虽然钯基标记试剂可以对细胞进行染色，这里细胞是根据其多种元素指纹进行检测的，因此使用掺杂钯的纳米塑料不会影响细胞检测。使用掺杂钯的纳米塑料与sc-ICP-TOF联用，提供了一种定量的检测纳米塑料和细胞相互作用的方法，同时还能平行检测每个细胞的多元素指纹。

因可同时记录多种元素，可进行多重事件sc-ICP-TOF检测。如图3所示，细胞的识别是基于同时检测到³¹P和⁶⁴Zn这一条件，纳米塑料的识别是同时检测到¹⁰⁶Pd和¹⁰⁸Pd且同位素分布与理论一致，同时检测到细胞指纹和纳米塑料指纹元素则被认为是互相作用事件。这种多元素同时检测在这种情况下尤其有用，因为它使我们能够直接评估纳米塑料和细胞的相互作用。即便如此，尽管很容易确定其相互作用，但无法区分细胞内化颗粒和细胞外表面结合颗粒。虽然并发信号通常代表纳米塑料与细胞的结合，但细胞和纳米塑料还有少许几率同时进入到等离子体，这种情况的概率是基于泊松并发分析计算得出（更多解释见原文补充材料）。在同时检测到细胞和纳米塑料相关联的所有事件中，这种情况占不到1%。也可通过进一步稀释悬浮液，这种假阳性关联概率将进一步降低。

图3 THP-1细胞暴露于5 μg/L掺杂钯的纳米塑料颗粒的时间轨迹，其中不同种类可识别为高于背景的脉冲信号，即（C）没有关联纳米塑料的单个THP-1细胞、（P）纳米塑料和（A）纳米塑料和THP-1相互关联事件

      为了评估对剂量依赖性吸收，研究人员将THP-1和A549细胞暴露于三种不同浓度（0.5 μg/L、5 μg/L、50 μg/L）纳米塑料中，对照组中纳米塑料浓度为0 μg/L，持续24小时。这些浓度不代表生理实际浓度，而仅仅是为了评估该方法的可行性。有文献报道人体血液中微塑料平均浓度为1.6μg/mL，高于我们的允许最高暴露浓度0.05μg/mL。当然研究人员可以测量更低浓度的纳米塑料颗粒，但需要增加分析时间，以便获得足够的事件进行可靠的统计分析。值得注意的是，该研究是对这一方法的原理验证。通过使用较高的暴露浓度，纳米塑料颗粒和细胞相互作用的事件数量将增加。但也可以合理预测，较低浓度的纳米塑料颗粒实验中，纳米颗粒及其与细胞的相互作用仍可被检测到。另外，此方法的优势还在于其适应性和自动化的潜力。自动进样器可以实现无人值守操作和自动数据处理，从而对更多的细胞进行分析，并有助于捕捉更多低暴露浓度下，纳米塑料和细胞之间的相互作用事件。

    原文-图4展示了不同条件下的细胞数量，所有样品种都检测到了类似数量的细胞（图4a和e）。正如预期，纳米塑料数量随着暴露剂量的增加而增加（图4b和f），纳米塑料与细胞的相互作用与暴露浓度呈正相关（图4c和g）。在对照非暴露细胞中也检测到一些纳米塑料，这可能是由于交叉污染。尽管如此，它们中检测到的颗粒浓度还是比暴露在0.5μg/L中的颗粒浓度低一个数量级。在大约4000个对照未暴露的细胞群事件中，仅检测到8个互相作用事件，因此交叉污染的影响可以忽略不计。观测到的纳米塑料浓度与细胞互相作用的正相关与其他纳米颗粒类似。随后，为了更好地了解细胞类型在纳米塑料与细胞互相作用中的差异，研究人员将数据基于细胞总数做归一化处理（图4d和h）。对于THP-1细胞，单细胞-塑料颗粒相互作用百分比在对照组为0%，0.5μg/L组为3%，5μg/L组为14%，50μg/L组为28%（见表S2）。对于A549细胞，在相互作用颗粒在对照组为0%，0.5μg/L组为3%，5μg/L组为14%，50μg/L为33%。这些研究结果表明，THP-1和A549细胞均表现出于纳米塑料浓度依赖性相互作用，并对纳米塑料具有类似的内吞能力。

      原文图4 细胞事件（图a和e）、纳米塑料事件（图b和f）和相互作用事件（图c和g）数量概览。实线表示各实验暴露重复的平均值，每个重复的平均值都用开符号表示。每次重复中检测的细胞和纳米塑料总数各不相同，但通常每次重复至少检测1000个细胞事件。图d和h显示每个重复的细胞总数进行归一化后的细胞-纳米塑料平均相互作用。平均值和单个重复值分别用水平黑线和黑点表示。总体而言，随着纳米塑料的暴露量增加，两种细胞系的颗粒相互作用都会出现浓度依赖性增加。

      在评估纳米塑料和细胞的相互作用时，需要考虑三个方面：1）与纳米塑料有互相作用的细胞比例；2）与每个细胞相互作用的纳米塑料数量；3）互相作用中观察到的异质性或同质性。需要注意的是，由于细胞中也有碳，因此需要区分细胞中的碳含量和纳米塑料中的碳含量非常复杂。虽然可以使用多元素指纹识别技术将微米尺寸的塑料和藻类细胞区分开，但纳米塑料的碳质量低，且碳元素灵敏度有限，因此无法检测到它们，需要其它的方法，如使用金属信号作为纳米塑料的替代物。在这里，使用的是钯信号作为单个纳米塑料的替代物检测。随后，根据每个纳米塑料的平均信号强度（图2b），纳米塑料峰值信号的大小与纳米塑料的浓度成正比，确定与每个细胞相互作用的纳米塑料数量（原文表S3）。与前文结果一致，纳米塑料数量越多，与细胞相互作用的纳米塑料数量越高。然而在计算相关纳米塑料的平均数量时，标准偏差很大，这表明两者相互作用相当不均匀。数据显示，在许多情况下，钯的信号强度非常高，这可能是因为多个纳米塑料与单个细胞相互作用，或一个细胞内有大的团聚体。这些较大的值可能成为离群值，并对平均值和标准差产生重大影响，因此采用了对极端值不太敏感的中位数来估计主要趋势。纳米塑料与细胞互相作用随着浓度的增加而增加。与0.5和5μg/L纳米塑料相比，在50μg/L暴露浓度下，纳米塑料与细胞的相互作用更多。总体而言，观察到的细胞与纳米塑料之间的相互作用相当不均匀。此外，有相当一部分的细胞与纳米塑料没有任何相互作用。这一发现强调了同种细胞群体与纳米塑料相互作用的多样性，表明需要进一步研究影响相互作用的因素。

     为了更好地理解sc-ICP-TOF检测的相互作用，并大致确定这些检测结果是否与纳米塑料细胞内化或表面粘附相对应，研究人员使用了透射电子显微镜（TEM）对暴露于50μg/L纳米塑料的细胞进行成像。结果显示，纳米塑料确实被这两种细胞内化（原文图5）。观察到的颗粒簇主要存在于细胞质的内细胞囊泡中，这表明内吞摄取机制非常活跃。这一发现与之前的一项研究类似，J774A.1小鼠的巨噬细胞和上皮细胞摄取40nm聚苯乙烯纳米颗粒的研究显示有多种内吞摄取机制参与其中，如吞噬作用、微胞饮、网格蛋白依赖性内吞和小窝蛋白依赖性内吞。此外，只有部分细胞中发现了纳米颗粒，这与上述sc-ICP-TOF数据一致，约30%的细胞中观察到了细胞与颗粒的相互作用。此外，从图像中可以看出，每个细胞含有不同数量的纳米塑料，这也再一次验证了原文表S3所示的sc-ICP-TOF的研究结果。然而，TEM不适合定量分析，一些细胞可能在成像切片以外的区域含有颗粒。事实上，这里选取的图像显示了更大的纳米颗粒群，支持了表S3中观察到的较大的平均值和标准偏差。但是，也有可能在另一个样品切片中会发现较少的纳米塑料。因此，通过上述两种技术的结合，研究人员能够更全面的了解纳米塑料和细胞之间的相互作用和每种分析方法的优势。sc-ICP-TOF的高通量能力提供了一种强大的统计分析，在大规模实验中对细胞与纳米塑料的相互作用进行了可靠的分析，而TEM则在纳米塑料在单细胞水平的内化提供了更详细的图像。 

     原文图5 纳米塑料的细胞吸收。A549和THP-1细胞暴露于0μg/L（未处理的对照组）或50μg/L的纳米塑料24小时后的TEM纤维照片。下行图像是上行图像中标记的细胞放大图，内化的纳米塑料用白色箭头表示。

     总之，sc-ICP-TOF在评估生物系统内颗粒相互作用方面有巨大潜力。首先，它比透射电子显微镜（TEM）和X射线光谱（EDX）相比，速度更快、通量更高，这种快速分析能在更短的时间内对单细胞进行高分辨率检测。其次，通过广谱元素扫描，sc-ICP-TOF能够根据单细胞的内源性元素进行分析，无需标记，减少了分析中可能出现的偏差和伪影。第三，它可以在单细胞基础上检测细胞与颗粒之间的相互作用，能够更准确地评估生物变异性。这样，sc-ICP-TOF能够让研究人员捕捉到样品内的异质性，并更好地了解颗粒在样品内和样品间的分布和位置。最后，sc-ICP-TOF还具有在极低水平上定量元素的潜力，从而可以检测和分析痕量元素、纳米颗粒或本研究中的金属标记，而其他技术可能会忽略纳米塑料。这种能力为研究细胞和微粒间微妙的相互作用提供了新的可能。研究人员还需要进一步优化和标准化这项技术，以便更广泛的使用：1）更高通量，更自动化，更高的细胞传输效率，以及2）更简化的数据后处理流程和规范化程序，以适应分析获得的高信息密度。尽管如此，sc-ICP-TOF还是一种前途无量的工具，可以促进对细胞-粒子相互作用机器在各种生物系统重的影响。

     在此，sc-ICP-TOF方法成功检测了掺杂钯的纳米塑料颗粒和人体细胞的相互作用。研究人员观察到纳米塑料在THP-1单核细胞和A549肺泡上皮细胞中的吸收呈浓度依赖性。单细胞水平的定量数据显示，这两种细胞类型相关的纳米塑料数量相似。有趣的是，在同一细胞群中，纳米塑料的吸收具有高度异质性，一些细胞与多个颗粒有相互作用，而大部分细胞不与纳米塑料颗粒有关联。这对未来评估纳米塑料的危害有重要意义，因为与颗粒数量关联度较高的细胞，尤其是摄取量较高的细胞，出现的生物反应不同。虽然目前的研究侧重于暴露时间（24小时）的影响，但未来的研究应调查不同的暴露时间，以了解纳米塑料随时间的相互作用。因此，先进的单细胞技术（如单细胞RNAseq）可用于补充本研究中获得的单细胞颗粒相互作用数据，以理解纳米塑料的毒性反应。尽管本研究是通过相对简单的体外单培养基进行的，但本文开发的sc-ICP-TOF方法可用于探索先进的共培养模型、类器官培养物或体内/体外组织。

      总体而言，评估纳米塑料对人体健康的危害目前是一个高度热门且重要的研究领域，然而研究人员在检测生物组织中的纳米塑料方面面临着分析方法的重大挑战。sc-ICP-TOF可为灵敏、快速地定量生物组织中金属标记的纳米塑料提供一种前景广阔的分析技术，以补充其他方法的不足，并获得对纳米塑料潜在毒性机制的新纬度解读。此外，本研究采用的是掺杂金属的纳米塑料，而现实中塑料碎片也含有金属添加剂，这些添加剂可能被用作纳米塑料的示踪剂。