2023-11-28 16:14:09, 赛默飞生命科学 赛默飞世尔科技生命科学产品
聚合酶链式反应(PCR)彻底改变了分子生物学领域,使科学家能够扩增DNA序列,用于各种应用,从基因分型到基因表达分析。然而,PCR的发展依赖于DNA聚合酶的进化,这些酶在PCR循环过程中介导DNA的合成。本文探讨了现代PCR的历史,从首次分离DNA聚合酶到Thermo Scientific™ Phusion™ DNA聚合酶等下一代聚合酶的开发历程。
追溯根源:PCR的简要历史
现代PCR的历史可以追溯到1976年,当时从嗜热细菌Thermus aquaticus中分离出了Taq DNA聚合酶。Taq DNA聚合酶迅速取得了成功;1989年,《科学》杂志将DNA聚合酶分子选为“年度分子”。在1988年,Kary Mullis和Cetus公司将该酶商业化,使其广泛应用。
尽管这些进展代表了重大的进步,但Taq DNA聚合酶仍有改进的空间。它容易出错,在高温下不稳定,难以扩增富含GC含量或具有复杂二级结构的DNA。为了提高PCR的性能并将PCR技术扩展到更广泛的应用范围,需要研发更先进的DNA聚合酶。
热启动聚合酶的发展
传统PCR中使用的Taq DNA聚合酶在较低温度下具有固有活性。这种活性可能导致非特异性扩增、假阳性结果和目标产量降低。热启动技术在20世纪80年代末被引入,作为克服Taq DNA聚合酶性能问题的解决方案。热启动PCR的方法使用酶修饰剂,如抗体、亲和体、适配体或化学修饰物,在室温下抑制DNA聚合酶的活性。在PCR的初始变性步骤之后,热启动敏感的修饰物被释放,聚合酶变得活跃起来。
通过热启动技术对聚合酶进行控制激活具有几个优点。首先,在PCR反应的初始阶段减少非特异性扩增的可能性,获得更清晰的条带和更高的目标DNA产量。热启动机制还提高了检测灵敏度,这在扩增低拷贝靶标时特别重要。最后,可以使用热启动DNA聚合酶在室温下配制反应体系,这一特点对于同时处理多个样本并使用机器人的高通量实验室尤为有益。
Pfu:PCR的新突破
1991年,从太平洋海底热液喷口中发现的嗜热古细菌 Pyrococcus furiosus 中分离和开发的Pfu聚合酶标志着分子生物学研究的重大突破。Pfu DNA聚合酶具有天然的3''到5''外切酶校对活性,可以纠正核苷酸插入错误,降低错误率,并提供增强的特异性。Pfu和Taq聚合酶的开发和使用持续了一段时间。PCR在一些开创性研究中起到了重要作用,例如1995年Ventner等人对流感嗜血杆菌的测序。然而,尽管这些聚合酶对许多基础应用非常有用,但它们无法提供所需的准确性、可靠性和读取长度,难以推动PCR进入新领域。
Phusion DNA聚合酶:下一代PCR技术
2003年推出的Phusion DNA聚合酶是开发下一代聚合酶和高保真PCR的第一步。这些经过特殊设计的DNA聚合酶可以克服或减少限制PCR发展的问题。第一代Phusion高保真DNA聚合酶源于具有热稳定双链DNA结合域的Pyrococcus-like酶,其具有高校对活性,对模板具有更高的亲和力,并且在长片段或高GC含量模板上表现良好。
多年来,Thermo Fisher Scientific一直在持续开发Phusion DNA聚合酶单酶、预混液和针对不同实验应用的试剂盒,例如定点突变和快速PCR。最近,Thermo Scientific推出了Phusion Plus DNA聚合酶,这是Phusion DNA聚合酶的升级版本,具有更高的保真度(> 100X Taq)、通用引物退火能力以及复杂样本高效扩增能力,使其使用更加方便和快速。
Phusion DNA聚合酶的广泛应用
01
清理石油泄漏
大多数石油泄漏发生在陆地上,而不是水中,但无论在哪里发生,生态和健康影响都是毁灭性的。研究人员一直在研究利用植物来修复受石油污染的场地。在最近的一项研究中,科学家们使用Thermo Scientific™ Phusion™高保真DNA聚合酶来帮助研究能够促进抗柴油燃料碳氢化合物生长的细菌物种的基因。这项研究的成功指向了一种未来,即细菌和植物可以协同作用,生态地清理燃料泄漏。
02
改善矫正医疗
在正畸手术后戴上的丙烯酸保持器必须进行清洁,以防止保持器表面形成生物膜。在一项独特的研究中,研究人员使用Phusion Plus DNA聚合酶进行PCR扩增,以研究戴保持器后口腔微生物群落的变化,以评估一种新的化学清洁产品的有效性。研究发现,消除保持器生物膜的最有效方法涉及化学和机械清洁(刷洗)的组合。
03
创建工业“细胞工厂”
酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae在工业生物技术中广泛用于生产燃料、化学品、食品成分和药品。然而,获取用于这些工业过程的高效性能菌株,通常需要对其代谢工程靶点进行广泛和昂贵的测试。Technical University of Denmark的研究使用CRISPR Cas9基因编辑和借助Phusion DNA聚合酶的PCR扩增相结合的方法,可以同时操纵几个代谢工程靶点,加速构建工业用途的细胞工厂。
04
改善农业生物杀虫剂
昆虫非常顽强,并且同样具有破坏性。产生Bt毒素的作物已被广泛应用于农业害虫管理,带来了可观的经济和环境效益。然而,昆虫害虫对Bt毒素产生了抗性,对这种害虫控制策略构成了严重威胁。在一项发表于《Nature》的研究中,研究人员使用Thermo Scientific™ Phusion™ U热启动DNA聚合酶开发了一种系统,可以演化出具有新型昆虫细胞受体亲和力的Bt毒素变种,以克服昆虫对Bt毒素的抗性。
05
应对蜱媒传染疾病
如果你熟悉莱姆病,你就知道蜱媒传染病对人类是一个严重的威胁。蜱媒传播的感染也对牲畜和宠物构成威胁,可能导致动物生病和死亡。鉴定引起这些感染的病原体可能具有挑战性,因为从动物身上取样的蜱经常充满动物血液,这可能对PCR酶产生抑制作用,使核酸扩增变得困难。研究人员比较了不同的从充满血液的蜱中提取DNA的方法,发现无论使用何种提取方法,Phusion Plus PCR Master Mix都是扩增蜱16s rRNA基因的高效工具。
06
利用粘液蛋白开发可生物降解的高分子材料
尽管对人类没有威胁,但天鹅绒虫(Onychophora)用强大的武器(粘液)攻击它们的猎物(如白蚁和小蜘蛛),粘液可以精确地从一英尺的距离射出。在喷射后,粘液包裹住猎物并经历快速的液相到固相转变。这种粘液是一种坚固且可完全降解的蛋白质材料,对于开发具有可持续性的高分子材料具有启发作用。结合转录组和蛋白组学研究,研究人员使用Phusion Plus DNA聚合酶验证了粘液蛋白的序列,获得了粘液蛋白的完整原始序列,并确定了粘液自组装的关键特征。该研究为可降解工业聚合物的开发开辟了研究路径。
在DNA发现70周年之际,也是Phusion DNA聚合酶上市20周年。为庆祝Phusion上市20周年,特此推出特价优惠活动:
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