基于EAD的Midde-Down分析全面表征生物制品的序列覆盖度和二硫键

2023-11-25 20:07:03, SCIEX SCIEX

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Middle-Down质谱分析是一种很有前途的生物治疗表征方法^1-5，Middle down MS可以比Top-Down MS提供了更高的序列覆盖率。与Top-Down MS相比，Middle-down MS受益于更简单的样品制备、更少的人工修饰、更容易的数据解释、更少的假阳性鉴定和更高的通量。传统的Middle-Down工作流的局限性之一是缺乏亚基序列中间的碎片信息，这种限制可以通过将EAD应用于二硫键连接的亚基来克服⁵。

先进的基于EAD的Middle-Down工作流程将准确的质量测量和信息丰富的EAD片段与自动化数据分析相结合，用于快速序列确认、准确的PTM定位和高置信度的二硫键图谱^1-5。在本文中，EAD的这些强大功能被用来提供一个几乎完整的序列。

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图1. 基于EAD的完全还原和二硫键连接的抗体亚基的Middle-Down分析。在2次进样中抗体亚基几乎完全实现序列覆盖（85%-93%）。EAD在单针进样中提供了完全还原的mAb亚基的高序列覆盖率（70%-85%）^1-4。EAD对二硫键连接的亚基的特征性断裂导致从2个中心Cys残基之间的序列中间检测到独特的片段，如覆盖图中的橙色线所示⁵。这些片段显著增加了序列覆盖率，并提供了链内二硫键的高置信度图谱。

生物治疗表征中基于EAD的Middle-down分析的关键特征

超高序列覆盖率：完全还原和二硫键连接的亚基，为EAD结果提供了抗体亚基85%-93%的序列覆盖率
高置信度二硫键图谱：EAD导致二硫键连接亚基的独特断裂模式，用于快速准确鉴定二硫键，假阳性低
PTMs的精确定位：不稳定的PTMs保留在EAD片段中以进行精确定位
简化且易于实施：工作流程只需最少的方法优化，从数据采集到结果审查都得到了简化

结果分析

完全还原和二硫键连接的抗体亚基，基于EAD的Middle-Down工作流程提供了一致的高序列覆盖率（70%-85%）和完全还原的抗体亚基的PTM的准确定位^1-4。对于二硫键连接的亚基，EAD导致特征性断裂模式，其中键断裂主要发生在二硫键形成区之外，能够在亚基水平上以高置信度和高保真度快速绘制生物治疗药物的二硫键图谱⁵。完全还原和二硫键亚基的互补EAD结果的组合提供了一种创新策略，以极小的人为修饰和假阳性实现生物治疗药物的全面表征。

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图2. Biologics Explorer软件中贝伐珠单抗的完全还原和二硫键连接的LC亚基的EAD MS/MS谱图。完全还原的LC亚基的EAD谱图显示在m/z约150-2100（A）的m/z范围内，而二硫键连接的亚基的EAD谱图显示在两个不同的m/z范围（约150-1400（B）和约1400-3850（C）内，以获得更好的谱图。EAD为完全还原和二硫键连接的LC亚基提供了极好的片段化和信息丰富的MS/MS谱图，从两个实验中获得了互补的结果。完全还原的亚基的EAD导致N端和C端区域的广泛断裂，序列中间的断裂有限。相比之下，二硫键连接的亚基的EAD片段主要发生在二硫键形成区域之外，包括贝伐珠单抗LC亚基中Cys88和Cys134残基之间的中心区域，导致在高m/z范围内检测到丰富的大c/z片段（C），用星号标记的峰是母离子或电荷还原的物质。

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图3. 贝伐珠单抗二硫键连接LC亚基的序列覆盖图。EAD导致片段的形成主要来自Cys23-Cys88和Cys134-Cys194之间的2个二硫键形成区之外，证实了该亚基中预期的链内二硫键，末端Cys214残基以其还原形式存在。

实现超高序列覆盖

如上所述，EAD导致生物治疗药物的完全还原和二硫键连接的亚基的互补断裂。二硫键连接的亚基的EAD导致序列中间的全面断裂，这一区域在完全还原的亚基中很难被打碎。结果，在二硫键连接的亚基的EAD中检测到许多独特的键断裂。这些裂解与EAD检测到的完全还原的亚基的裂解相结合，导致在2次进样中抗体亚基的超高序列覆盖率。

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图4. 来自2次EAD进样的NISTmAb LC、Fd和Fc/2亚基的组合序列覆盖图。完全还原的NISTmAb LC、Fd和Fc/2亚基的EAD导致单针进样中3个亚基的序列覆盖率为70%-80%¹。在3个序列覆盖图中，相应的键断裂由蓝线和红线表示。二硫键连接的亚基的独特EAD片段模式使得能够从不受二硫键限制的区域检测到许多独特的片段，包括序列的中间碎片。这些独特的碎片由3张覆盖图中的橙色线条突出显示。两次进样结合的EAD结果导致3个NISTmAb亚基的序列覆盖率为85%-91%，二硫键连接亚基的EAD产生的独特片段贡献了约10%-16%的绝对增加。Fd亚基序列中突出显示的N-末端谷氨酰胺残基（中图）被转化为焦谷氨酸。Fc/2亚基序列中突出显示的Asn残基（右图）用G0F聚糖修饰。

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图5. 来自2次EAD进样的贝伐珠单抗LC、Fd和Fc/2亚基的组合序列覆盖图。两次进样的完全还原和二硫键连接亚基的联合EAD结果导致3个贝伐单抗亚基的序列覆盖率>90%。由二硫键连接亚基的EAD产生的独特片段，如3个覆盖图中的橙色线所强调的，有助于序列覆盖率增加约10-16%。Fc/2亚基序列中突出显示的Asn残基携带G0F聚糖。

除了提供独特的键裂解外，二硫键连接亚基的EAD还提供了快速的二硫键图谱，并证实了EAD检测到的完全还原亚基的N-和C-末端裂解，这些益处显著提高了抗体序列表征的置信度。

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图6. 来自tsAb的LC亚基的组合序列覆盖图。EAD检测到的二硫键连接亚基的独特裂解，如橙色线所示，有助于序列覆盖率增加10%。

总之，本文中描述的创新的基于EAD的Middle-Down策略通过利用完全还原和二硫键连接的亚基的互补EAD结果，在2次进样中实现了生物治疗药物的超高序列覆盖率（85%-93%）。这种强大的策略还能够基于二硫键连接的亚基的EAD结果在亚基水平上进行高置信度的二硫键鉴定。这种创新的Middle-Down策略通过克服Top-Down在片段效率和序列覆盖率方面的缺点，以及Top-Down在人为修饰、数据复杂性、假阳性和通量方面的局限性，为生物制药的全面表征提供了一种平衡的方法。该策略可以大大提高Mid-down MS对生物治疗药物的综合表征的效率和有效性。

总结

一种创新的基于EAD的Mid-down MS策略在2次进样中实现抗体亚基的超高序列覆盖率（85%-93%）
EAD为二硫键连接的亚基提供的特征性断裂模式，能够以高置信度和高保真度快速绘制二硫键图谱
完全还原和二硫键连接的亚基的EAD实现了互补片段化
该强大的策略为完全或部分还原的生物样品提供了深入的表征
Biologics Explorer软件提供易于使用的Mid-down工作流模板和强大的可视化工具，可改善数据分析的用户体验

参考文献

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1. A streamlined single-injection middle-down workflow using electron activated dissociation (EAD) for biotherapeutics characterization.

SCIEX technical note, MKT-26997-A.

2. Obtaining high sequence coverage and confident posttranslational modification (PTM) analysis of biotherapeutics using an electron activated dissociation (EAD)-based middle-down workflow.

SCIEX technical note, MKT-27223-A.

3. Comparative analysis of biotherapeutics using an electronactivated dissociation (EAD)-based middle-down workflow.

SCIEX technical note, MKT-27427-A.

4. Confident sequence analysis of a trispecific antibody using an electron-activated dissociation (EAD)-based middle-down workflow.

SCIEX technical note, MKT-27784-A.

5. High-confidence disulfide bond mapping of biotherapeutics using an electron-activated dissociation (EAD)-based middle-down workflow.

SCIEX technical note, MKT-28341-A.