应用分享|Absolute Q数字PCR助力AAV基因治疗病毒滴度定量

2023-11-25 15:19:28, 市场部&张晓光赛默飞世尔科技生命科学产品

AAV基因治疗技术的发展

近年来，全球范围内越来越多的基因治疗制品进入临床或上市，其中，重组腺相关病毒(rAAV)因其具有免疫原性低、向性强、基因转移高效持久的特点，广泛应用于人类基因疗法。目前国外已有6款AAV产品获批上市，国内也有近30款的AAV品种获得了临床许可，并有多款产品进入到临床III期。

另一方面，在快速发展的同时，基因治疗制品的质量控制也面临诸多挑战，在这种情况下，中国食品药品检定研究院联合业界专家，参考了大量国内外指南与规范，并经过充分调研，于今年6月共同编写了《基因治疗制品质量控制概述》。

数字PCR技术在AAV基因

治疗领域的应用

在中检院推出的《基因治疗制品质量控制概述》中，多处提到了一种新型的技术手段——数字PCR方法可用于质控环节。具体涉及以下检测项目：

对于工艺相关杂质的检测应包括宿主细胞成分和工艺添加物的残留，宿主细胞DNA总量检测可采用数字PCR等方法，尤其是风险基因E1A检测可采用Q-PCR、数字PCR等方法

基因组DNA/RNA 或质粒的拷贝数(如Q-PCR、数字PCR等)进行适宜的组合来测定原液和成品的含量，并用参比物质/对照物质进行比较计算或对照控制

在AAV的三质粒生产中，质粒作为一种生产起始原材料，需要对其残留予以检验和控制。制品中质粒DNA残留的质量控制，主要用Q-PCR扩增特定区域检测。为简化检验步骤，该区域最好为转染的三质粒所共有。为明确区分质粒DNA、宿主DNA和重组AAV病毒DNA，该区域不应在宿主基因组和重组AAV病毒基因组中出现。针对该区域设计特异性引物，建立Q-PCR或数字PCR检测方法，并进行验证

此外，病毒载体的滴度按不同层面可以分为总颗粒数、基因组滴度和感染滴度，其中基因组滴度是病毒基因组拷贝数，通常通过Q-PCR法或数字PCR法进行定量。

那么数字PCR与Q-PCR方法对比有何优势呢？

新型数字PCR技术的特点

数字PCR将批量反应分成数万纳升大小的微反应，与Q-PCR相比，具有更高的精确性和再现性。优点包括：

定量数据输出——数据点转换不依赖参考或标准

单分子分辨率分析可对含有多个靶标的分子进行定量，从而了解分子的完整性

提高了对PCR抑制剂的耐受性等

随着数字PCR技术的快速发展，市场上也涌现出了各种不同的数字PCR技术，其中基于物理分割法的芯片式数字PCR技术因为其分析的稳定性和均一性好，相关产品的市场拓展非常迅速。

赛默飞基因科学于近年来推陈出新，推出新型芯片式数字PCR产品QuantStudio Absolute Q。

与其他依赖随机过程通过液滴形成产生微反应的数字PCR方法不同，Absolute Q的微流体阵列式芯片板 (MAP) 技术便于自动将样品一致地分配到20480个微反应孔中，其中大于99%的微反应孔可产生有效数据，从而最大限度地减少样品损失

与MAP技术相结合的QuantStudio Absolute Q是一款全集成单仪器数字PCR系统，其工作流程简单且与qPCR的工作流程类似，需要的手动操作大大减少，该系统满足了重组AAV生产工作流程中对高度准确和可再现病毒滴度定量的需求

高效：可在90分钟内生成数据。非常适合在细胞基因疗法研究中快速、准确地定量rAAV

Applied Biosystems™ QuantStudio™ Absolute Q™

数字PCR系统-全自动一体机

Absolute Q测定AAV病毒

滴度——工作流程

样本制备

采用含有AV两个末端反向重复序列(ITR-2)区域的DNA片段，并将其连续稀释10倍，共产生5个稀释度。

检测方法

按表1所述方法准备dPCR反应，并在基于MAP技术的QuantStudio Absolute Q数字PCR系统上运行dPCR反应。将反应物(9μL)转移到QuantStudio Absolute Q MAP 16板上，然后每孔覆盖15μL的QuantStudio Absolute Q分离缓冲液。加装条形垫片后，将板转移到系统上。基于MAP的dPCR的简单实验工作流程如下图所示。

表1. 基于MAP的dPCR的反应混合物制备

图1.在基于MAP的QuantStudio Absolute Q数字PCR系统上快速简便地完成实验工作流程

数据分析公式

在下面公式中，利用基于MAP技术的dPCR的QuantStudio Absolute Q数字PCR分析软件和液滴式dPCR相关软件所报告的浓度，计算每个稀释度中AAV靶标的浓度(cp/μL)。

公式：储备溶液浓度计算公式。对于基于MAP的dPCR，总反应体积为9μL，样品上样体积为1.8μL；对于在液滴式dPCR系统上运行的样品，总反应体积为20μL，样品上样体积为4μL。

实验分析与结论

图2. 基于数字PCR对连续稀释样品中的AAV定量

采用QuantStudio Absolute Q数字PCR系统，通过统计荧光标记阳性的微反应腔总数，即可在4个数量级的动态范围内对10倍连续稀释样品的AAV拷贝进行绝对定量。

图3. QuantStudio Absolute Q数字PCR系统和液滴式dPCR的AAV定量动态范围

(A) 采用QuantStudio Absolute Q数字PCR系统和液滴式dPCR，利用公式 1计算出的AAV浓度。五个稀释度的定量单位均为 cp/μL。(B) 储备溶液浓度预计值与dPCR绝对定量值之间的相关性。在计算液滴式dPCR的线性回归时，仅考虑已检测动态范围内的数据。图中显示了回归线(实线)及其相关的95% CI(虚线)。

图4. 比较Absolute Q数字PCR系统与液滴式数字PCR平台的数字化一致性和废弃样品百分比

(A) 在基于MAP的QuantStudio Absolute Q数字PCR系统和液滴式dPCR平台上并行运行的五个AAV稀释度中，每次dPCR反应所接受的微反应腔或液滴总数的分布情况。(B)QuantStudio Absolute Q数字PCR系统和液滴式dPCR平台中每次反应的废弃样品百分比。

分析结论

QuantStudio Absolute Q数字PCR系统工作流程简单，非常适合在细胞和基因疗法研究中快速、准确地定量rAAV；微流体阵列式芯片板(MAP)技术可利用＞99± 0.03%的可用微反应腔进行稳健的样品物理分隔，而液滴式技术仅能产生~90±14.01%的预计液滴量，动态范围更小。

Absolute Q测定AAV病毒

滴度的进一步拓展

正如上面对《基因治疗制品质量控制概述》的引用和解读中提到，从AAV表达系统的早期开发阶段到生产放大和最终产品放行，在rAAV载体生产的各个阶段都需要准确一致的病毒滴度测定——基因组滴度和病毒粒子滴度的定量以及完整衣壳/空衣壳比例是rAAV的重要属性。然而，对于它们定量的方式并不统一。可以采用其他有限的方法测定rAAV的单一特征：qPCR测定的是基因组滴度，而ELISA测定的是病毒粒子滴度。完整衣壳/空衣壳比例可结合qPCR和ELISA数据进行推断，或通过电子显微镜、分析超速离心法或高压液相色谱法进行独立测量。

邻位连接检测(PLA™)是一种免疫检测方法，它利用PCR扩增技术进行定量，并能在单个qPCR平台上同时进行完整衣壳和空衣壳研究。然而，这种方法需要利用标准曲线和参考标准来确定粒子滴度和基因组滴度。因此，该方法更容易受到检测间差异以及完整衣壳和空衣壳中基因组含量不均一引起的差异的影响。

而数字PCR(dPCR)可对核酸靶标进行绝对定量，无需标准曲线，并可消除差异。我们通过概念验证实验在此证明了Absolute Q dPCR系统多重反应中的基因组滴度和衣壳滴度定量方法。Absolute Q还能在进行衣壳定量的同时进行连锁分析，从而使用户更全面地了解完整衣壳和部分衣壳。

通过数字PCR平台进行的AAV-PLA

以下是我们通过相关验证实验，证明了Absolute Q数字PCR系统多重反应中的基因组滴度和衣壳滴度定量方法。Absolute Q还能在进行衣壳定量的同时进行连锁分析，从而使用户更全面地了解完整衣壳和部分衣壳。

在Absolute Q平台上，通过双重反应，即可测定AAV2(ATCC，货号：VR-1616)和AAV6(Vector Biolabs，货号：7008)的基因组滴度、病毒颗粒滴度和完整衣壳/空衣壳比例。

图5.两种rAAV血清型的dPCR结果

邻位连接检测试剂和Absolute Q AAV ITR2检测试剂(A52740)在dPCR上的双重反应。利用从QuantStudio Absolute Q dPCR系统获得的拷贝/μL 结果乘以形成样品所需的稀释因子计算得出VP/mL和 GC/mL，用基因组滴度除以病毒粒子滴度计算得出完整粒子的百分比。每个稀释度N=4。

图6. 两种rAAV血清型的qPCR结果

邻位连接检测试剂和Absolute Q AAV ITR2检测试剂(A52740)在qPCR上的双重反应。VP/mL和VG/mL由Vigene公司提供的表征良好的 AAV 参考标准(RSAAV2-FL 和 RS-AAV6-FL)的标准曲线得出。用基因组滴度除以病毒颗粒滴度计算得出完整病毒颗粒百分比。

对于所检测的两种AAV血清型，根据dPCR得出的完整衣壳/空衣壳比例与根据qPCR标准曲线得出的相同测量值非常吻合。与dPCR相比，qPCR测定的病毒颗粒滴度和基因组滴度相对略高，由于标准曲线或参考物质初始浓度不准确，qPCR滴度可能被高估。

各种AAV血清型与PLA和

TaqMan™ Assays™兼容

采用PLA和几种Taqman Assays，对Vigene公司提供的AAV 参考标准(AAV2：RS-AAV2-FL，AAV6：RS-AAV6-FL)和Amsbio公司提供的AAV参考标准(AAV1：CV10003，AAV5：CV10005)进行了评估。不同血清型的AAVX抗体的结合效率可能不同，可能需要进一步优化。AAV1、2和 6的ITR2结果均在CoA预期浓度的 5% 范围内。由于检测到两个ITR2拷贝以及ssDNA封装效率不高，因此对ITR2浓度的估计高于PLA或病毒粒子浓度。对多个基因组靶标进行检测，可以更清楚地了解这些参考标准中包裹的病毒DNA完整性。

图7. 采用血清型1、2、5和6的AAV-PLA

使用qPCR和ITR特异性引物，测定生产商提供的CoA基因组滴度。双重反应由PLA检测和Absolute Q AAV ITR2 Assay组成，每个血清型N=4。

通过 dPCR评估AAV基因组完整性

采用多重检测法检测不同的AAV基因组靶标有助于显示完整或部分AAV衣壳的基因组完整性(图8)。Absolute Q dPCR将DNA分子分成数千个微反应腔，从而以单分子分辨率评估AAV的基因组组成。然而，在偶然情况下，无法将连锁靶标与共同占据一个微反应腔的两个靶标区分开来(图8)。连锁分析计算出的双阳性微反应腔数量并非偶然引起的双占位。连锁结果的百分比不受DNA输入浓度的影响。

图8. AAV质粒的TaqMan Assays示意图

用于检测AAV病毒的TaqMan Assay包括Absolute Q AAV ITR2 Assay(A52740)三种定制TaqMan Assay，这些定制Assay分别靶向增强型绿色荧光蛋白(eGFP)(标记FAM荧光)、猿猴病毒40(SV40)polyA 信号(标记ABY荧光)和巨细胞病毒启动子(CMV)(标记JUN荧光)。Vigene公司提供了AAV2和AAV6的 DNA 序列。

图9. 在eGFP-CMV双阳性微反应腔中检测到的DNA组合

可产生eGFP和CMV双阳性荧光的五种可能的DNA分子组合。图9显示了通过多重连锁分析得到的2D点阵图。

在Absolute Q dPCR系统上，采用四种Taqman Assays对AAV2和AAV6进行检测。对三种浓度(ITR2 lambda：0.7、0.2、0.05)的样品进行了检测。连锁百分比的计算如Regan，2015所述。结果表明，不同基因组靶标之间的连锁情况各不相同，这可能是由于存在部分AAV衣壳和ssDNA链的3'' 端偏向性。

图10. AAV2和AAV6的连锁分析

在Absolute Q dPCR平台上，采用靶向ITR2(VIC)、SV40(ABY)、eGFP(FAM)和CMV启动子(JUN)的 TaqMan Assay对 AAV2和AAV6病毒颗粒进行检测。对照 DNA是包含所有四个靶标序列的人工DNA片段。所有Taqman Assays均加入在同一dPCR反应中进行多重化检测。对照样品的N=4，三种浓度AAV2和AAV6的N=6。红色方框表示已进行连锁检测的靶标。

利用dPCR上的多重数据计算

完整衣壳/空衣壳比例

根据图11中的结果计算连锁分子的绝对浓度，再除以图3中AAV2和AAV6的PLA结果，计算出完整衣壳/空衣壳比例，结果发现该比例在很大程度上取决于所选的基因组靶标(图6)。由于在图3中观察到ITR2的拷贝/μL高于PLA的拷贝/μL，因此预计完整衣壳/空衣壳比例会超过100%。利用连锁分析，检测多个AAV基因组靶标，可以改进对功能基因组的估计。

图11. AAV2和AAV6的完整衣壳/空衣壳比例

在Absolute Q dPCR平台上，采用靶向ITR2(VIC)、SV40(ABY)、eGFP(FAM)和CMV启动子(JUN)的TaqMan检测法对AAV2和AAV6粒子进行检测，并在同一dPCR反应中多重化。利用图 5 中单个靶标的拷贝/μL结果或根据连锁分析得出的拷贝/μL 结果计算得出完整衣壳/空衣壳比例，然后除以图3中的PLA结果。利用透射电子显微镜，测定CoA完整衣壳百分比。每个靶标N=2。

实验结论

在这项研究中，我们采用了市售的纯化AAV病毒颗粒作为检测样品。这些实验数据证明了在单次双重dPCR反应中测定AAV基因组滴度、病毒颗粒滴度和完整衣壳/空衣壳比例以及利用多重dPCR反应的连锁分析研究AAV基因组完整性的可行性。这项研究证明了Absolute Q数字PCR系统改进和进一步简化AAV表征的能力，从早期开发阶段到生产放大和最终产品放行，基因疗法工作都能从中受益。

问卷有礼

扫描右下方二维码填写问题卷，将有机会获得EASY便携包一份！