核酸质谱之漫话五: 核酸质谱法鉴定非洲猪瘟病毒

2023-11-22 12:54:30 北京东西分析仪器有限公司





2023年以来,国内关于非洲猪瘟的消息就此起彼伏,从北到南覆盖众多省份,本篇将主要介绍核酸质谱技术在鉴定非洲猪瘟方面的内容






非洲猪瘟(Infection with African swine fever virus,简称:ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine fever virus,简称:ASFV)感染家猪和各种野猪而引起的一种急性出血性的烈性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病,该病也是我国重点防范的一类动物疫情。其特征是发病过程短,最急性和急性感染死亡率高达100%,临床表现为发热(达40~42℃),心跳加快,呼吸困难,部分咳嗽,眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物,皮肤发绀,淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血。

非洲猪瘟疫情严重危害生猪养殖及相关产业的发展。其病程短、传播快,致死率高,控制难度极大。因保护性免疫反应的复杂性,目前尚无有效的疫苗进行预防,从而被称作养猪业的“天敌”。自1921年非洲猪瘟首次被确认起,在百年间的几次暴发,都可称为养殖业的灾难。2018年8月开始非洲猪瘟在我国广泛流行,席卷大半个中国,给我国养猪业带来的损失相当严重。而由于ASFV传播的隐蔽性和复杂性,该流行病仍未解决。尽管人类早就发现了ASF,但缺乏安全有效的疫苗。因此,寻找有效可靠的诊断方法对控制ASF疫情至关重要。

非洲猪瘟病毒基因分型的意义

ASFV是一种双链DNA病毒,具有24种已知基因型。该病毒由四层蛋白质外壳和一个内源性基因组组成,其结构比许多其他病毒复杂得多。此外,其多层结构对其复制和存活起着重要作用。


目前非洲猪瘟病毒的主要检测方法及局限性

目前针对非洲猪瘟的病原学诊断技术包括抗原检测、活病毒检测和核酸检测等。主要分为针对病毒抗原、抗体反应的免疫学技术和针对病毒DNA的核酸检测技术等。

  • 酶联免疫吸附试验(ELISA):是当前最为常用的免疫学诊断技术,抗体必须要感染病毒达到一定程度才会出现,无法对ASFV的早期感染做出诊断。

  • 在猪感染非洲猪瘟病毒的早期,借助于聚合酶链式反应(PCR)等分子生物学技术可实现对病毒核酸的检测。具有较低的敏感性,仅属于最简单的分子生物学检测技术。

  • 病毒分离-红细胞吸附测定(HAD):病毒分析是一种验证方法,其相应的分析(红细胞吸附分析)耗时,只能用于验证具有红细胞吸附特性的菌株。此外,它必须在生物安全三级实验室中进行,限制其应用。

  • 等温扩增技术适用于快速现场检测。然而,它的灵敏度略低于荧光PCR。

  • 由于使用多种方法和实验来检测多个基因既耗时又费力,因此使用目前可用的qPCR方法只检测到少数基因。


多重PCR+核酸质谱技术进行非洲猪瘟快速分型鉴定的优势

  • 时间短:无需培养分离。

  • 极高的特异性:达95–100%。

  • 更高的灵敏度:不受病原体活性的限制,允许DNA检测受损或死亡的病原体。

  • 早期筛查:感染早期甚至症状出现之前即可识别阳性病例。

  • 高通量:每天可检测上千个样本。

  • 用于ASFV检测及基因分型鉴定:如B646L基因编码的ASFV的主要衣壳蛋白p72被用作诊断流行性ASFV及其分型的首选蛋白;    

  • ASFV毒力强弱分株:如基于CD2(EP402R)的SNP和MGF505部分缺失与否,可以区分I型强毒株和弱毒株;

  • 区分野生株和疫苗株:如在制造疫苗建立基因缺失菌株的人工构建过程中,通常靶向EP402R(CD2v)、MGF和A137R等基因



东西分析再升级多重PCR+核酸质谱技术


东西分析经过多年的开发,运用多重PCR+核酸质谱技术,成功开发出“非洲猪瘟病毒基因分型、毒力强弱分株和基因缺失检测试剂”。此试剂集荧光PCR和PCR测序技术为一体,采用核酸质谱独特的高重数PCR质谱SNP精细测序优势,结合自身研发的《DNA二维码扫描》专利技术,在一个PCR反应中将以下三个功能合为一体:

  • 24个基因分型:根据国标检测P72(B646L)基因区的型特异SNP位点,通过单点或多点组合,区分24种基因型;

  • 毒力强弱分株:根据农业部相关指南的靶标基因分析,发现基于CD2(EP402R)的SNP和MGF505部分缺失与否,可用三靶标区分I型强毒株和弱毒株;

  • 基因缺失:根据疫苗基因(EP402R、MGF505-3R和A137R)缺失组合鉴定疫苗基因缺失株。东西分析多重PCR+核酸质谱技术适用于非洲猪瘟病毒分型、毒力强弱分株和区分野生株与疫苗株基因缺失的市场需求。有助于农业、海关等部门从分子水平追溯引发非洲猪瘟疫情的病毒来源、监测ASFV在我国的分布以及流行趋势、掌握和阻断病毒潜在的传播途径及可能的传播方式,对于ASFV的有效防控具有重要意义。


仪器展示


Ebio Reader 3700 Plus飞行时间质谱仪


操作简单

无需复杂的样品前处理。


性能稳定

长寿命固体激光器;

飞行管随环境温度、湿度的变化小,保证检测的稳定;

高效网筛离子源,提高仪器的灵敏度;

PIE高压脉冲电源控制,实现离子的延迟推斥,提高整体仪器的分辨能力 


软件智能

基于神经网络聚合分类法的人工智能软件;

拥有强大数据库,实现对菌种的实时鉴定;

具备聚类分析功能,可进行T-test等数据分析

具有自建库功能,可根据用户实际情况建立自有菌种库;

可根据用户具体需求,进行相应升级,用于疾病蛋白标志物和核酸基因分型的检测。


应用范围广

广泛用于临床、疾控、食品安全、农业、工业、出入境检疫等领域。



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