2023-11-17 17:52:15 Illumina因美纳(中国)科学器材有限公司
使用广泛的探针捕获
精确宏基因组学(PMG)开展废水AMR监测
Jacob Bierstedt,Morgan Roos,
Scott Kuersten,Courtney Gonzalez,
Kate Broadbent
通过对废水等环境样本进行基因组筛查来监测AMR趋势,是个体样本检测的替代方法,可减轻公共卫生实验室样本采集的负担,并通过标准化分析方法提供社区层面的AMR频率和丰度信息5,6。凭借这些优势,基于新一代测序(NGS)的废水AMR监测正在迅速获得关注,并有助于开发缓解全球AMR威胁的策略1。但是,尽管克服了个体采样中存在的一些挑战,但针对从环境来源收集的样本,基于NGS的AMR检测方法仍然面临挑战6。其中的一个挑战是AMR序列只占环境样本中总DNA的一小部分6。
鸟枪法宏基因组测序方法十分适用于优先考虑AMR标志物发现的应用或需要无假设微生物检测的应用。然而,用于环境AMR监测的鸟枪法需要深度测序,且可能无法在废水等复杂基质中提供足够的灵敏度7。靶向NGS代表了一种独特、精确的环境AMR监测方法7。通过探针捕获开展靶向NGS,可以显著增加AMR靶标的reads,从而在降低测序深度的同时提供更高的AMR标志物检测灵敏度7。
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泌尿道病原体/耐药基因检测试剂盒(UPIP,因美纳,仅供研究使用)专用于广泛和准确地检测微生物和AMR序列。与基于鸟枪法的采样方法相比,能够采用较低的测序深度检测与人类健康相关的序列。UPIP能够靶向170多种泌尿生殖系统病原体和3700多种AMR标志物,其中包括3600多种完整AMR基因,包含了综合抗菌药物耐药性数据库(CARD,版本3.2.5)8 中超过75%的AMR基因,涵盖了美国疾病预防控制中心(CDC)9 重点列表中75%的AMR威胁以及WHO10重点列表中83%的相关基因(表1)。凭借广泛的靶标范围,UPIP AMR panel可作为主要候选产品用于开展基于NGS的环境样本AMR监测。为了检验UPIP试剂盒在废水AMR监测方面的性能,我们使用NovaSeq™ 6000系统在两种条件下(使用和不使用UPIP试剂盒)对废水样本进行了测序,每个样本平均生成300M条总reads,并比较了不同下采样测序深度的AMR产量(表2)。
表1.UPIP靶向的CDC和WHO重点病原体。
表2.样本测序平均reads数为300M。UPIP富集样本被下采样至5M、10M、20M和50M条reads。鸟枪法样本被下采样至20M、50M、100M和150M条reads。
UPIP富集显著提高了AMR检测效率:reads数量提高了>2500倍,
测序深度提高了>3500倍,
检测量提高了>3倍
从短读长测序数据中检测AMR标志物需要reads与AMR基因参考序列之间具有高比对覆盖度和一致性,这取决于从样本中生成的AMR reads产量、高质量且全面的参考数据库分析和软件解决方案。UPIP捕获探针旨在提高靶向AMR序列的测序产量,Explify UPIP数据分析BaseSpace Sequence Hub(BSSH)中提供的配套应用程序旨在生成具有高覆盖度和高一致性的共有序列和比对,从而准确检测AMR标志物。
我们使用Explify应用程序(v1.0.0)的样本组成功能估计了AMR序列(在使用及未使用UPIP检测的条件下)的测序reads比例。Explify样本组成功能使用基于kmer的方法将reads分为各种类别,例如“人类”、“细菌”或“AMR”。UPIP检测样本中CARD(版本3.2.5)AMR序列的reads中值为50%,而鸟枪法样本的reads中值为0.02%。即使测序深度降低30倍,通过UPIP检测,AMR类别的序列reads比例也高出2500倍(图1)。平均而言,UPIP检测样本5M条总reads中有2.4M条属于AMR序列,而鸟枪法样本150M条总reads中有0.03M条属于AMR序列。总之,UPIP检测产生了更多分属于AMR序列的reads,能够支持下游检测算法。
图1A:UPIP检测样本与鸟枪法样本中AMR标志物的reads百分比。虚线表示reads占比的中位数。
图1B:使用基于kmer的reads分类时,UPIP富集样本(总reads:5M)与鸟枪法样本(总reads:150M)的样本组成。左图显示的是UPIP靶向序列的总样本reads的百分比。右图显示的是非UPIP靶向序列的总样本reads的百分比。CARD(版本3.2.5)中75%的AMR基因是UPIP的靶标。
我们接着研究了reads比对指标,评估UPIP富集对AMR标志物reads深度、检测和覆盖度的直接影响。UPIP富集样本(总reads为10M)中检测到的AMR标志物的读取深度中值比reads总数达10倍以上的鸟枪法样本(总reads为100M)高379倍。采用相同的测序深度,UPIP富集的reads深度中值提高了3783倍(图2)。此外,UPIP样本中检测到的AMR标志物数量是鸟枪法样本的三倍,reads总数为50M(图3A),并且检测到的具有100%比对覆盖度的AMR标志物占比也明显更高。UPIP样本中,检测到的AMR标志物中达到100%覆盖度的占90.5%,reads总数为10M,而鸟枪法样本中的这一比例为63.7%,reads总数为100M(图3B)。
图2A:UPIP样本(总reads:5M)与鸟枪法样本(总reads:50M)中检测到的AMR标志物的中位reads深度比较。
图2B:UPIP样本与鸟枪法样本的中位reads深度的增加倍数。虚线表示平均中位reads深度。
图3A:UPIP样本与鸟枪法样本中的AMR标志物检测。
图3B:在UPIP样本和鸟枪法样本中,比对覆盖度占序列长度的比例。
UPIP检测法提高了AMR变异检出能力
提高AMR测序效率对于准确检测低丰度AMR标志物和AMR标志物变异至关重要。因此,我们研究了UPIP检测法对AMR标志物变异检测的影响。Explify应用程序在所有UPIP样本(5M至50M条reads)中检测到了glpT基因中的E448K突变11。对于鸟枪法样本(20M至150M条reads),均未检测到相同的突变,但在reads数超过200M的8个原始鸟枪法样本中,有两个检测到了相同的突变。我们观察到,在UPIP样本中,该位置的平均深度为每百万总reads占85条reads,而鸟枪法样本中的读取深度为0.02,这表明,UPIP检测法在较低总测序深度下能够更好地检出废水样本中与耐药性相关的变异(图4)。
图4.UPIP样本与鸟枪法样本中glpT的平均覆盖深度。
检测重点病原体和潜在的AMR
UPIP靶向的170多种泌尿生殖系统病原体中报告了CDC9观察列表中的12种病原体(表1)。我们利用Explify应用程序的自动化微生物和AMR标志物检测结果,检查了与CDC重点威胁相关的病原体和AMR标志物的共同检测情况。我们发现,UPIP靶向的12种病原体中,有6种至少在一份样本中能够使用潜在的AMR标志物检测出来(图5)。在UPIP富集样本中(总reads至少为10M),均能检测到这12种病原体。在鸟枪法文库中检测到了肠球菌属(Enterococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),后两种仅在总reads至少为100M的文库中检测到。在UPIP样本中,所有测序深度均检测到潜在的AMR标志物。值得注意的是,仅在UPIP富集样本中检测到抗万古霉素(例如vanA、vanB、vanC、vanD、vanRA、vanHA、vanYA)和抗甲氧西林(例如mecA、mecR1、mecI)的AMR标志物。在本分析中,潜在的AMR标志物是指与给定病原体具有已知关联的标志物或标志物组合。
图5.CDC重点病原体和潜在AMR标志物的共同检测9。橙色表示使用该栏所示的测序深度,在至少一个样本中检测到病原体或潜在的AMR标志物。
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