JACS 适用于流式细胞仪的镁离子检测探针 | 前沿用户报道

2023-11-17 14:58:12, 小小小在学习 HORIBA科学仪器事业部

今日文献分享为2023年10月发表在JACS上的文章，“Ratiometric Fluorescent Sensors Illuminate Cellular Magnesium Imbalance in a Model of Acetaminophen-Induced Liver Injury.”通讯作者是来自纽约大学的Daniela Buccella教授（研究方向生物无机化学，化学生物学，分子成像）和来自西班牙生物科学合作研究中心(CIC bioGUNE)肝病实验室的 María L. Martínez-Chantar教授。

2017年，Kazuya Kikuchi等设计了基于喹啉的三齿螯合 Mg²⁺的新型荧光探针，探针本身对钙离子不敏感，适用于细胞内动态检测 Mg²⁺的浓度变化，但是这类探针在螯合 Mg²⁺后导致荧光淬灭，并且会受到 pH 影响（图1）。在此基础上，本文作者设计了比率型荧光探针（图2），可耐受 pH 变化，不受 Ca²⁺影响，其发光机制是利用喹啉母核的分子内电荷转移（ internal charge transfer (ICT) ）并且，利用此探针作者研究了药物性肝损伤（DILI）细胞模型中CNNM4蛋白表达与Mg²⁺浓度之间的关系。（ CNNM4:cyclinM4,细胞周期蛋白M家族，在 Mg²⁺跨细胞膜转运中起关键作用。）

图1 previous work（Chem. Commun., 2017,53, 10644-10647）

图2 this work (J. Am. Chem. Soc. 2023, 145, 40, 21841-21850)

Mg²⁺正常生理水平浓度为0.5-1.2 mM,所设计探针 MagZet1 与 Mg²⁺结合后，最大吸收波长从 488 nm 蓝移至430 nm，最大发射波长从 500 nm 红移至 530 nm，其 Kd值在 0.14 mM ,其灵敏度满足生理测试。并且，探针对其它二价金属离子无明显响应，竞争实验也表明其对 Mg²⁺的选择性更好。

图3 (J. Am. Chem. Soc. 2023, 145, 40, 21841-21850)

在生理环境中，ATP 与镁离子结合后发挥正常功能，所以 ATP 是天然的镁离子生物螯合剂。低密度的探针或螯合剂倾向于形成探针-镁离子-生物分子[MagZet1·Mg2+·ATP]三元配合物，这可能会干扰对游离的生物基质中游离 Mg2+ 的研究。但是，根据探针与 MgATP 的解离常数为 100 mM,远高于生理环境中镁离子浓度。所以，MgATP 不会干扰 MagZet1 对游离的 Mg2+ 的检测。

图4 (J. Am. Chem. Soc. 2023, 145, 40, 21841-21850)

在进行细胞实验之前，作者将探针用 AM（acetoxymethyl ester）修饰，增强其透膜性，观察到细胞内均匀的荧光信号，给予细胞 EDTA 和钙离子载体处理，细胞内荧光强度显著降低，并且此比率型荧光探针适用于流式细胞术检测胞内镁离子浓度。

图5 (J. Am. Chem. Soc. 2023, 145, 40, 21841-21850)

最后作者探讨了药物肝损伤细胞模型中镁离子浓度与 CNNM4 蛋白之间的关系，细胞内经 10 mM 对乙酰氨基酚处理 3h，观察到细胞内荧光降低，表明镁离子浓度下降，对参与镁离子转运相关的蛋白表达量进行分析，发现 CNNM4 表达上调，同时，RT-qPCR 也检测到了 TRPM6 的上调，这在之前的患者样本中并未发现。

图6 (J. Am. Chem. Soc. 2023, 145, 40, 21841-21850)

总之，本文主要是基于之前文献报道的 Turn-off 的探针进行结构改造，1. 探针实现比率型荧光检测镁离子浓度变化；2. 探针对生理pH不敏感，且不受钙离子干扰；3. 探针不受 MgATP 复合物干扰；4. 基于此探针的比率荧光检测，使其适用于流式细胞术实现胞内镁离子的检测，这是其最重要的突破；5. 利用此探针可以探究疾病发展过程中 Mg²⁺浓度与其相关转运蛋白表达之间的关系。

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