2023-10-30 11:08:08, 毫厘科技HaoLi 杭州毫厘科技有限公司
如果说PCR技术的出现彻底变革了现代分子生物学,那么Taq DNA连接酶的应用则是PCR技术的“点睛之笔”。1976年,科学家从一种叫做水生栖热菌(Thermus aquaticus)的嗜热细菌中分离出具有极高的热稳定性的Taq DNA连接酶,在至今40多年的应用发展中,野生型Taq DNA连接酶已经被定向改造进化,以满足不同操作场景的需求。
Taq DNA连接酶作为IVD领域重要的原料之一,不仅要满足客户对酶本身性能的需求,同时还要保证较高且稳定的产品质量。对于体外诊断试剂产品,往往对原料本身的质量控制极其严格,否则会影响检测结果的准确度、精密度、稳定性、检测限度等,从而延误患者的治疗时间,甚至让医生做出错误的方向判断。
高质量的Taq DNA聚合酶原料,诞生于企业良好的质量意识、合理的生产工艺和规范的生产操作。Taq DNA聚合酶在PCR技术中,用于对目的序列的有效扩增,为了实现这一过程快速、高特异性、高灵敏度、目的序列扩增完整等目的,需要控制Taq DNA连接酶原料的纯度、宿主细胞内/外切酶残留量、宿主细胞核酸残留量和酶活等关键质量点。
高质量Taq DNA聚合酶的生产
分子进化后的Taq DNA聚合酶生产通常分为三个步骤:发酵表达、分离纯化和制剂。为了方便重组Taq DNA聚合酶的分离纯化,在分子构建过程中,往往会在酶分子上构建最为方便常用的His标签。同时,根据Taq DNA聚合酶自身的物理化学性质和分子生物学特点,毫厘科技推出高质量Taq DNA聚合酶的纯化生产工艺:
Ⅰ Taq DNA聚合酶的粗纯捕获
——SpreX Ni-NTA Elite/Max
His-Taq DNA连接酶通常为大肠杆菌发酵表达,部分生产工艺中常会在菌体破碎离心后,添加一步硫酸铵沉淀,来实现一次粗纯,并对目的蛋白浓缩,以方便后续Ni离子亲和层析纯化,减少上样体积。但硫酸铵沉淀的过程通常耗时费力,同时,由于发酵样品的不稳定性,也难以精细地把控每次实验结果的稳定性。毫厘SpreX Ni-NTA Elite/Max产品,能够在更高的操作流速下保持高载量,即使发酵液没有经过硫酸铵沉淀处理,也能够在更短的时间内,完成对样品的纯化。SpreX Ni-NTA Elite/Max粒径分布极窄,微球均一度高、分辨率高、对于宿主细胞蛋白(Host Cell Protein,HCP)残留更低,能够整体降低后续杂酶分离的压力。同时,SpreX Ni-NTA Elite/Max介质所带来的更小的洗脱体积,都有利于后续脱盐和稀释处理。发酵样品在直接经过SpreX Ni-NTA Elite/Max纯化后,His-Taq DNA连接酶纯度通常>90%。
Ⅱ Taq DNA聚合酶中度纯化
——Pocar Heparin 6 FF
Pocar Heparin 6 FF为肝素亲和层析介质,肝素分子含有大量的磺酸基和乙酸基团,是已知的生物大分子中,被认为带负电荷密度最高的物质,其聚阴离子结构与核酸类似,所以能够与核酸结合蛋白相结合。Taq DNA连接酶经过SpreX Ni-NTA Elite/Max介质纯化后,再经Pocar Heparin 6 FF介质进一步亲和纯化,能够有效去除粗纯后残留的HCP和宿主细胞核酸(Host Cell DNA,HCD)。毫厘Pocar Heparin 6 FF介质粒径分布均一,具有高分辨率,在分子酶纯化场景中,能够对微量残留的宿主细胞内/外切酶和Taq DNA连接酶与核酸的复合体进行有效的分离。粗纯样品经过Pocar Heparin 6 FF介质纯化后,His-Taq DNA连接酶纯度通常>98%。
Ⅲ Taq DNA连接酶精细纯化
——Pocar Q 6 FF/SpreX Q
Pocar Q 6 FF和SpreX Q介质为阴离子交换层析介质,毫厘科技基于微流控微液滴成球技术所开发的层析介质产品,粒径分布均一可控,在实际使用过程中能够表现出更高的分辨率,在离子交换层析过程中表现更为明显。经过Pocar Heparin 6 FF中度纯化的Taq DNA连接酶通常在SDS-PAGE或液相分析下,蛋白纯度通常已经达到要求,但对宿主细胞内/外切酶和宿主细胞核酸残留的控制仍然需要进一步提升。游离的宿主细胞核酸相对于蛋白,通常具有与介质更强的结合能力。同时,与核酸结合的Taq DNA连接酶,也在带点性上,与Taq DNA酶具有一定的差异。Pocar Q 6 FF或SpreX Q的高分辨率,能够有效分离游离核酸与Taq DNA连接酶与核酸的复合体。Taq DNA连接酶经过精细纯化后,通常纯度>99%,内/外切酶经检测无残留,宿主细胞核酸残留小于限值(RT-PCR检测)。
欢迎体验与试用
目前毫厘已上市一系列层析产品,如您有纯化需求,欢迎体验技术服务和产品试用更多产品咨询、合作意向、微流控及微球材料研发定制,请联系我们,期待与您合作共促发展!
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