IVD核心原料Taq酶纯化｜无核酸残留&无内外切酶残留，毫厘高质量整体方案

2023-10-30 11:08:08, 毫厘科技HaoLi 杭州毫厘科技有限公司

点击蓝字，关注我们

如果说PCR技术的出现彻底变革了现代分子生物学，那么Taq DNA连接酶的应用则是PCR技术的“点睛之笔”。1976年，科学家从一种叫做水生栖热菌（Thermus aquaticus）的嗜热细菌中分离出具有极高的热稳定性的Taq DNA连接酶，在至今40多年的应用发展中，野生型Taq DNA连接酶已经被定向改造进化，以满足不同操作场景的需求。

Taq DNA连接酶作为IVD领域重要的原料之一，不仅要满足客户对酶本身性能的需求，同时还要保证较高且稳定的产品质量。对于体外诊断试剂产品，往往对原料本身的质量控制极其严格，否则会影响检测结果的准确度、精密度、稳定性、检测限度等，从而延误患者的治疗时间，甚至让医生做出错误的方向判断。

高质量的Taq DNA聚合酶原料，诞生于企业良好的质量意识、合理的生产工艺和规范的生产操作。Taq DNA聚合酶在PCR技术中，用于对目的序列的有效扩增，为了实现这一过程快速、高特异性、高灵敏度、目的序列扩增完整等目的，需要控制Taq DNA连接酶原料的纯度、宿主细胞内/外切酶残留量、宿主细胞核酸残留量和酶活等关键质量点。

高质量Taq DNA聚合酶的生产

分子进化后的Taq DNA聚合酶生产通常分为三个步骤：发酵表达、分离纯化和制剂。为了方便重组Taq DNA聚合酶的分离纯化，在分子构建过程中，往往会在酶分子上构建最为方便常用的His标签。同时，根据Taq DNA聚合酶自身的物理化学性质和分子生物学特点，毫厘科技推出高质量Taq DNA聚合酶的纯化生产工艺：

Ⅰ Taq DNA聚合酶的粗纯捕获

——SpreX Ni-NTA Elite/Max

His-Taq DNA连接酶通常为大肠杆菌发酵表达，部分生产工艺中常会在菌体破碎离心后，添加一步硫酸铵沉淀，来实现一次粗纯，并对目的蛋白浓缩，以方便后续Ni离子亲和层析纯化，减少上样体积。但硫酸铵沉淀的过程通常耗时费力，同时，由于发酵样品的不稳定性，也难以精细地把控每次实验结果的稳定性。毫厘SpreX Ni-NTA Elite/Max产品，能够在更高的操作流速下保持高载量，即使发酵液没有经过硫酸铵沉淀处理，也能够在更短的时间内，完成对样品的纯化。SpreX Ni-NTA Elite/Max粒径分布极窄，微球均一度高、分辨率高、对于宿主细胞蛋白（Host Cell Protein，HCP）残留更低，能够整体降低后续杂酶分离的压力。同时，SpreX Ni-NTA Elite/Max介质所带来的更小的洗脱体积，都有利于后续脱盐和稀释处理。发酵样品在直接经过SpreX Ni-NTA Elite/Max纯化后，His-Taq DNA连接酶纯度通常＞90%。

Ⅱ Taq DNA聚合酶中度纯化

——Pocar Heparin 6 FF

Pocar Heparin 6 FF为肝素亲和层析介质，肝素分子含有大量的磺酸基和乙酸基团，是已知的生物大分子中，被认为带负电荷密度最高的物质，其聚阴离子结构与核酸类似，所以能够与核酸结合蛋白相结合。Taq DNA连接酶经过SpreX Ni-NTA Elite/Max介质纯化后，再经Pocar Heparin 6 FF介质进一步亲和纯化，能够有效去除粗纯后残留的HCP和宿主细胞核酸（Host Cell DNA，HCD）。毫厘Pocar Heparin 6 FF介质粒径分布均一，具有高分辨率，在分子酶纯化场景中，能够对微量残留的宿主细胞内/外切酶和Taq DNA连接酶与核酸的复合体进行有效的分离。粗纯样品经过Pocar Heparin 6 FF介质纯化后，His-Taq DNA连接酶纯度通常＞98%。

Ⅲ Taq DNA连接酶精细纯化

——Pocar Q 6 FF/SpreX Q

Pocar Q 6 FF和SpreX Q介质为阴离子交换层析介质，毫厘科技基于微流控微液滴成球技术所开发的层析介质产品，粒径分布均一可控，在实际使用过程中能够表现出更高的分辨率，在离子交换层析过程中表现更为明显。经过Pocar Heparin 6 FF中度纯化的Taq DNA连接酶通常在SDS-PAGE或液相分析下，蛋白纯度通常已经达到要求，但对宿主细胞内/外切酶和宿主细胞核酸残留的控制仍然需要进一步提升。游离的宿主细胞核酸相对于蛋白，通常具有与介质更强的结合能力。同时，与核酸结合的Taq DNA连接酶，也在带点性上，与Taq DNA酶具有一定的差异。Pocar Q 6 FF或SpreX Q的高分辨率，能够有效分离游离核酸与Taq DNA连接酶与核酸的复合体。Taq DNA连接酶经过精细纯化后，通常纯度＞99%，内/外切酶经检测无残留，宿主细胞核酸残留小于限值（RT-PCR检测）。