赛默飞Vanquish HPLC快速定量分析乳品中A2β酪蛋白

2023-09-08 18:03:26, 飞飞赛默飞色谱与质谱分析

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郑喆董玮洁

牛乳是公认营养价值较高的蛋白质来源，牛乳中蛋白质主要为酪蛋白（占比83%）、乳清蛋白和乳球蛋白^[1]。牛乳中的酪蛋白主要有四种：αs1、αs2、β（占比45%）和κ^[2]。而β酪蛋白又存在13 种不同的遗传变体，其中A1、A2 型最常见^[3-4]。起初所有家养牛的乳中均仅含有A2β酪蛋白，自然基因突变作用下出现了A2β酪蛋白的各种变体。仅含A2β酪蛋白的牛乳与母乳成分相似，对儿童认知、大脑发育大有裨益；而且可以提高机体免疫力，降低冠心病的发病率，改善乳糖不耐受患者胃肠道的不适反应^[5-6]。

基于A2β酪蛋白对人体的各种益处，全球各大乳品企业都纷纷推出A2型婴配或纯牛奶乳品。但是由于缺乏针对A1、A2β酪蛋白统一的国家检测标准，导致监管缺失，市场上A2型乳品宣传也成泛滥之势，真正的A2乳品容易被淹没在伪A2乳品中，企业利益受损。消费者缺乏专业知识和检测手段无法有效甄别所购A2乳品的真伪，无法维权。这一切都是因为没有能快速、准确、低成本定量分析A1与A2酪蛋白的检测方法。

本文基于赛默飞Vanquish Core高效液相色谱平台，针对乳品中A2β酪蛋白定量建立了简单、快速的高效液相色谱分析方法。本文系列方法对于后续深入开展A2β酪蛋白定量工作具有指导意义。

仪器配置：

Thermo Scientific™ Vanquish™ Core HPLC高效液相色谱系统包括：

泵：Quaternary Pump CN（P/N：VC-P21-A-01）

自动进样器：Split Sampler C（P/N：VC-A13-A-02）

柱温箱：Column Compartment C（P/N：VC-C10-A-03）

检测器：Vanquish Variable Wavelength Detector C（P/N：VC-D40-A-01）和流通池（P/N：6077.0200）

软件：Chromeleon CDS 7.3

方法一梯度方法：

流动相：A：0.1%TFA水溶液；B：0.1%TFA乙腈

进样量：1 ~10µL；

色谱柱：XB-C8 4.6*150mm，3.6um；

柱温：45℃；

检测器波长：214nm；

线性实验制作标准工作曲线：2.8mg/mL标品，分别进样1、2、4、6、8、10uL，制作标曲。标曲叠图如图1所示，标曲数据详见表1。

图1. 六针标曲进样叠图

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表1. 标曲数据

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稳定性实验：样品十针进样叠图显示精密度非常好，见图2，重现性数据详见表2。

图2. 十针进样叠图

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表2. 十针进样重现性数据

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实测样品，依据2.24mg/mL标品谱图分离和积分情况，对样品谱图采用分组自动积分方法获取相关峰面积数据，见图3。

图3. 标品和样品叠图

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方法二等度方法：

流动相：A：0.1%TFA水溶液；B：0.1%TFA乙腈；

进样量：1 ~10µL；

色谱柱：Acclaim 300 C18 4.6*150mm，3.0um；

柱温：45℃；

检测器波长：214nm；

线性实验，标准工作曲线制作：2.24mg/mL标品，分别进样1、2、4、6、8、10uL，制作标曲。标曲叠图如图4所示，标曲数据详见表3。

图4. 六针标曲叠图

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表3. 标曲数据

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稳定性实验，2.24mg/mL标品六针进样叠图见图5，重现性数据详见表4。

图5. 标品六针进样叠图

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表4. 六针进样重现性数据

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实测样品实验

实测样品，依据0.896mg/mL标品谱图分离和积分情况，对样品谱图采用自动积分方法获取相关峰面积数据，见图6。

图6. 实际样品与标品谱图叠图

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结论

基于赛默飞Vanquish Core高效液相色谱仪，建立了乳品中A2β酪蛋白的两个快速定量分析方法。本文对于乳品企业制定A2β酪蛋白的质控方法、对于农林高校科研、对于政府质检部门出台标准，具有参考意义。

参考文献：

1. 高彩雯，罗龙龙，任卫合，马石霞，余金凤，代安娜，丁功涛，陈士恩. 牛乳中Ａ２ β－酪蛋白功效特点及其检测方法研究进展. 黑龙江畜牧兽医. ２０２２（０３）：１９－２４.

2. MEIER S, KORKUC P, ARENDS D, et al. DNA sequence variants and protein haplotypes of casein genes in German Black Pied cattle (DSN)[J]. Frontiers in Genetics, 2019, 10(5): 11-29.

3. 罗卉卉，金素钰，黄林，等．牦牛β－酪蛋白Ａ１、Ａ２型遗传变异体的基因和蛋白质水平分析［Ｊ］．黑龙江畜牧兽医，２０２０（０６）：１３３－１３５，１４０，１５８．

4. 李建斌，刘文娇，王秀革，等．奶牛β－酪蛋白基因分型及Ａ２型牛群培育技术研究进展［Ｊ］．中国奶牛，２０１７（６）：３１－３３．

5. 张玉梅，石羽杰，张健，等．母乳α－乳清蛋白、β－酪蛋白与婴幼儿健康的研究进展［Ｊ］．营养学报，２０２０，４２（１）：７８－８２．

6.SOKOLOV O, KOST N, ANDREEVA O, et al. Autistic children display elevated urine levels of bovine casomorphin-7 immunoreac⁃tivity[J].Peptides,2014,56:68-71．

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