【干货】RT-qPCR快速进阶全攻略

qPCR实验通常需要设置三个生物学重复，对于不同的实验处理，还要有3个技术重复。

● 生物学重复：同一处理下的不同植株、细胞系、动物个体等。

● 技术重复：同一实验材料所包含的复孔。

实验对照是实验的监控系统，用以监测实验是否存在异常。在qPCR实验中，实验对照通常有NTC对照和NRT对照。

● NTC：无模板对照，用来验证实验材料是否被污染或是否存在引物二聚体，一般用水做模板。

● NRT：采用未经反转录的RNA做模板，以检测gDNA的残留情况。

在进行相对定量PCR实验时，需要选择合适的内参基因对不同样本的基因表达水平进行校正。

常用的内参基因包括Actin、GAPDH、18S rRNA等。内参基因的选择可参考已发表文献或通过具体实验来筛选；也可通过内参基因数据库来检索，如中科院内参基因数据库（ICG http://icg.big.ac.cn/），里面涵盖了200多个物种的内参基因信息。

实验时可参照荧光定量反应试剂说明书来设置反应程序。一般建议采用两步法PCR反应程序进行实验，若因模板量较低等因素导致扩增效果不佳，可调整为三步法反应程序。

反转录获得的cDNA体系比较复杂（包含引物、dNTP、Buffer等多种成分），其中的部分成分在OD260处同样有吸光值，反转录后直接用产物测量无法获得准确的cDNA浓度。

对于高丰度基因，在定量时可将cDNA稀释4-10倍；低丰度基因不建议稀释。在不确定基因表达丰度的情况下，可将cDNA做梯度稀释，然后根据定量Ct值确定最佳稀释度。

引物纯度对反应特异性影响很大，建议使用PAGE纯化级别以上的引物。收到引物干粉后需根据说明书将引物稀释配制成100 μM的母液分装保存，实验时将母液稀释至10 μM再使用。引物终浓度为0.3 μM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。如需进一步优化，可以在 0.2-0.5 μM范围内调整引物浓度。

ROX是一种惰性参比染料，不参与PCR反应。ROX作为阳性参比，可对其它荧光信号进行归一化，以校正孔间差异。使用不同qPCR仪时ROX染料的用量不同。

通常引物退火温度比引物的解链温度(Tm)低5℃，如果引物碱基数较少，可适当提高退火温度，提升PCR的特异性；如果碱基数较多，可适当减低退火温度。建议先采用说明书推荐的退火温度，如需进一步优化，可以尝试在原退火温度上下5℃范围内进行调整。

对于染料法荧光定量，我们一般通过扩增曲线、熔解曲线来衡量qPCR结果的好坏。

扩增曲线应为平滑的S型曲线，能够到达平台期。阳性样本的Ct值在15-30之间；NTC样本无扩增曲线或Ct＞35；复孔间Ct值之差小于0.5或STD＜0.2。

熔解曲线有单一锐利的峰，Tm值在80-90℃之间，NTC样本无目标基因峰。

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