心跳的感觉｜Olink助力肺动脉高压患者右心室衰竭标志物LTBP-2筛选

2023-06-09 14:10:19, Shirley Zhong 上海欧易生物医学科技有限公司

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研究背景

右心室功能是肺动脉高血压发病和死亡的主要决定因素，但右心室重塑的分子机制和反映其功能的循环因子尚不清楚。肺动脉高压患者中右心室重构事件通常分为2个阶段，但哪些分子参与了这些重塑事件也了解的不够清楚。其中NT-proBNP 通常用于辅助临床决策，因为它的表达水平与患者血流动力学、右心室功能和存活率相关，但其受到多个混杂变量的影响（如左心疾病、肾功能、年龄和并发症等），所以该指标并不能特异性地反映肺动脉高压患者右心室重塑的所有病理生理学。临床上仍急需寻找有效的RV 靶向治疗药物以及可用于诊断和疗效预测的循环生物标志物。

在过去的几年里，高通量RNA 测序 (RNA-seq) 技术的发展在很大程度上有助于更好地了解各种疾病的病理生理过程。然而，RNA 水平并不能代表蛋白质的丰度，且药物的主要靶点往往是蛋白质。因此，整合转录组学和蛋白质组学的数据有望帮助我们更好地理解疾病机制，促进新治疗靶点的发现。此外，体液的蛋白质组学分析还能发现早期检测的可靠生物标志物，以用于疾病监测、疾病进展和预测药物治疗效果。

加拿大魁北克大学心脏病和肺病研究所的专家们及美国杨森研发中心、英国谢菲尔德大学的合作者们在《Nature Cardiovascular Resaerch》上发表了相关研究成果。

结合蛋白质组学（Olink血浆蛋白质组图谱）与转录组学，研究者鉴定到一组与心脏纤维化相关的蛋白质，它们在右心室失代偿的肺动脉高压患者的右心室组织和血浆中也有上调。多组学分析得到的数据随后经过验证队列的验证，确定了LTBP-2（一种分泌型基质蛋白），可以作为右心室衰竭的新因子和生物标志物来预测肺动脉高压患者的预后。

实验设计示意图

部分名词缩写：

PAH：肺动脉高压

RV：右心室

cRV：代偿性右心室

dRV：失代偿的右心室

研究结果

1. 对人类右心室衰竭进行转录组和蛋白质组的比较分析

作者将临床患者中获得的右心室组织样本，分类为cRV、dRV 和CTRL (健康成年人对照)。

采用主成分分析(PCA)分别对转录组(图1A)和蛋白质组(图1B)进行分析，每个点代表一个样本（绿色为对照、红色为cRV患者、蓝色为dRV PAH患者）。可以看出，在CTRL 与cRV 两个人群的组织中，转录组和蛋白质组的表达水平差异都比较小，而dRV 患者的表达水平与CTRL 与cRV 的差异均较大。

图1. 转录组和蛋白组数据进行整合分析‍

对转录组和蛋白组数据进行整合分析(图1C) ，通过Circo Plot 和韦恩图（venn diagram）展示了dRV 和CTRL 之间重叠的差异表达编码基因(DEG)和蛋白质(DEP)，在检测到的基因-蛋白质匹配中，作者定义了作为具有相应的检测蛋白质的检测基因，总共 60个基因中有10个被检测到在转录和转录水平都受到调控翻译水平，其中58个(97%)显示一致的表达模式（33个上调，25个下调）。从结果可以看到几种与心肌壁完整性和心脏适应压力相关的蛋白，如SORBS2、MLIP 和DSG2 在mRNA 和蛋白质表达水平均下调，而多种ECM 相关蛋白，包括COL6A3，COL18A1， LTBP-2、VCAN和TNC 在mRNA 和蛋白质表达水平均上调。多组学的结合创建了研究右心室衰竭的潜在机制和潜在改善右心室功能的参考数据集。

2. 对肺动脉高压患者进行Olink 血浆蛋白质组分析

发现队列：来自加拿大的28名健康对照和60名肺动脉高压患者（其中cRV=31例、dRV=29例），采集的样本均采用Olink Explore 384 Cardiometabolic Panel 进行大规模血浆蛋白质组分析。

图2.热图分析

1）热图分析显示(图2a)，与健康对照相比，PAH 患者中有62种蛋白质显著上调，在相同的阈值条件下，没有发现显著下调的循环蛋白。

2）与健康对照组相比，PAH 患者血浆中的NT-proBNP、NPPB 蛋白的NPX 表达水平显著升高。同时研究者们为了评估Olink 方法的性能，还研究了PEA 方法与临床测量血浆NT-proBNP方法（西门子的NT-proBNP 诊断试剂)的一致性，从图2b中可以看出这两个值的相关性非常高 (r= 0.9368，P < 0.0001)，表明 Olink 方法的准确性和灵敏度非常可靠。

3）与健康对照组相比，将dRV 的PAH 患者的转录组数据、右心室组织蛋白组数据和Olink血浆蛋白中上调的循环蛋白用维恩图展现出来出来（图2c），三个数据集的交集显示了5个共同的蛋白（LTBP-2、COL6A3、COL18A1、 TNC和CA1），其主要与纤维化相关。在图2d中综合了对照组和PAH 患者（cRV 和dRV 两组）的这五种共有因子的血浆NPX 蛋白表达水平，差异非常显著，在PAH 内部的两个分组间差异均不显著。

3. 在独立队列中验证选定的生物标志物

验证队列：来自英国谢菲尔德心肺研究中心收集的血浆样本，56名健康对照和61名PAH 患者，所有样本均采用Olink Explore 384 Cardiometabolic Panel 进行大规模血浆蛋白质组分析，分别探索了5种共有蛋白质（LTBP-2、COL6A3、COL18A1、 TNC 和CA1）以及NT-proBNP 各自的临床相关性。所有数据与在发现队列中得出的结论非常一致。

5种共有蛋白质（LTBP-2、COL6A3、COL18A1、 TNC和CA1）的NPX表达水平与预后的相关性见图3。

图3.5种共同蛋白在健康对照与PAH

作者分别做了三类比较：a：健康对照组与PAH 患者组；b：根据抽取血样时通过右心导管术测量的心脏指数（CI值），将PAH患者归为2类cRV 和dRV 组；c：健康组和IPAH 组和CTD-PAH 组，PAH 患者根据发病原因不同又归类为IPAH（特发性肺动脉高压）和CTD-PAH（肺动脉高压相关的结缔组织病），不管PAH 患者如何分类，5种共同蛋白在健康对照与PAH 组均存在显著差异（图3A）。

4. 血浆蛋白标志物对两个联合队列患者预后的预测价值

在总共205个体中，NT-proBNP、LTBP-2、COL6A3、 COL18A1、TNC 和CA1 在患者中显著上调，PAH 与对照组相比显著上调，其中dRV 患者相比cRV 患者也显著增加。ROC 分析显示LTBP-2、COL6A3、COL18A1 和TNC 与无移植的肺动脉高压患者存活率显著相关。在这些生物标志物中，LTBP-2 蛋白具有最高的AUC（图4）。

图4.血浆蛋白标志物对两个联合队列预后预测

与发现群组和验证群组一致，单独来看，未经调整的Cox 比例风险分析显示 LTBP-2、COL6A3、COL18A1 和TNC 与PAH 患者的无移植存活率显著相关。多变量分析表明，只有LTBP-2 仍然是一个独立的风险后的预后因素。

图5.Cox 多元分析

最后，作者进行了Cox 多元分析，建立了预后风险评分的逻辑回归模型的ROC 分析及其与LTBP2的组合。分别根据改进的四级风险评估方法、REVEAL 2.0风险评分和2015年ESC/ERS风险评分，以及三种评分方法组合LTBP-2 因子之后进行比较。可以发现，LTBP-2 指标的加入可以极大提高三种风险评分方法的敏感性。

研究结论

对多组学的使用并基于多组织优先化策略，不仅证实了一些以前被表征的生物标志物的作用，还发现了新的具有更强预测价值的生物标志物，其也是改善肺动脉高压的右心室功能潜在的药物靶点。

同时，本文研究与已往发表数据有很大不同。作者把它归功于采用了Olink 的PEA 技术，其优势在于可以高通量的测量低水平表达的循环蛋白因子，解决了血浆蛋白质组检测的复杂性，且无需通过其它平台进行数据验证。采用PEA 技术更有利于发现新的有价值的生物标志物，比如本文中LTBP-2 的发现，该蛋白迄今为止还没有被其它商业蛋白质组分析技术所覆盖。

参考资料：1.Identification of LTBP-2 as a plasma biomarker for right ventricular dysfunction in human pulmonary arterial hypertension. Nature Cardiovascular Research, https://doi.org/10.1038/s44161-022-00113-w

参考文献：10.1016/j.xcrm.2023.101057

文末看点｜lumingbio

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