DS3000上GlobalFiler™ Express PCR Amplification Kit的性能

2023-06-02 17:48:11 日立诊断产品（上海）有限公司

概要

GlobalFiler™ Express PCR Amplification Kit (Applied Biosystems™)是常用于DNA分析的试剂包之一，可通过单一/多重PCR扩增包括European Standard Set和CODIS(Combined DNA Index System) 推荐的基因座集的24个标记。

本报告检测出从DS3000 Compact CE Sequencer上的GlobalFiler™ Express PCR Amplification Kit中获得的样品的数据质量。通过分析灵敏度、精度、重复性，得出了DS3000 Compact CE Sequencer的性能满足使用GlobalFiler™ Express PCR Amplification Kit实现DNA分析的结论。

结果

基因分型

首先分析了DS3000的分离性能。为此，将 GlobalFiler™ Express PCR Amplification Kit(GlobalFiler™)的等位基因标准物用3台仪器进行了8次电泳，实施了共96次的验证。

等位基因标准物是每个遗传标记中的所有对立等位基因的混合物，由长度范围为76–440bp的343个峰组成，信号的最小间距为2bp。表1与图1所示96次验证中，所有峰都被正确分离及鉴定。

图1. 等位基因标准物的电泳图

X轴和Y轴表示各个DNA的大小和信号强度。

每个方框中上部的绿条处，表示所有预期的等位基因都在各自的基因座已被正确地识别。

表1. 等位基因标准物的等位基因识别状态

成功的运行结果表示，等位基因梯的所有预期等位基因均被特定地复制。

其次，用GlobalFiler™ 对2纳克的DNA质控品007进行了基因分型后，将获得的DNA(PCR扩增子）在聚合物4上进行了电泳。在本试验中，还检查了等位基因标准物的使用频次。图2所示等位基因标准物与PCR扩增子的排列。

图2. 样品排列

所示样品盒上的等位基因标准物(A)与PCR扩增子(P)的位置。

白色圆圈表示空管的位置。

在1-4或者5-8试管中进行同时注入同列样品。

同一天在不同的仪器上分析了等位基因标准物与条件4的扩增子。

简而言之，将PCR扩增子与等位基因标准物平行注入(条件1），同一天与等位基因标准物分离注入(条件2），两天后 (条件3），或在同一天在不同仪器上进行注入(条件4)。在上述所有条件下，基因分型均取得了成功(表2)。PCR扩增子的典型电泳图如图3所示。

令人惊讶的是，即使是另一台仪器上获得的等位基因标准物也取得了成功 (表2条件4)。这一结果表明了仪器的可靠性。然而，GlobalFiler™的用户指南，要求与样品 (1）相同的条件下使用等位基因标准物。这只是对仪器性能的评估，请勿在实际操作中尝试。

表2. DNA质控品007的基因分型

成功次数表示扩增子中所有已被识别的预期等位基因的复制品的个数。

图3. PCR扩增子的电泳图

将条件1的样品用聚合物4进行分析。X轴和Y轴表示各个DNA的大小和信号强度。

每个方式上部的绿条处，图3是足以进行基因判定的优质的电泳图。

灵敏度

将DNA的注入量从250pg逐次减少到31.3pg，与每个PCR扩增子平行注入等位基因标准物。

表3所示，注入量为125pg时与预期的基因型的一致率为100%，注入量为62.5pg时的一致率为81%，并且注入量为31.3pg时的一致率下降到44%。在此结果上很难进行可靠的分析。

表3. 低注入量DNA的基因分型

将PCR扩增子(6个复制品)与等位基因标准物(两个复制品)进行平行注入。检测率是指已被识别(观测到的)峰数与预期的总峰数的比。

表4. 低注入量DNA的检测率

各个方式的检测率用颜色区分。低于100%，表示理想的峰值被消失，因而较难进行数据分析。此数值越低，分析越困难。

精度

表5总结了等位基因标准物每个峰的预计大小的变化。观察到的精度与用户指南(1)中描述的精度相同。

表5. Sizing精度的最大值

利用四道毛细管，对于等位基因标准物在3台仪器上各进行8次电泳，反复进行了96次分析。标记与等位基因表示最大(最差)Sizing精度。

*1: Sizing精度由整个毛细管预计DNA片段大小的标准差(SD)来表示。SD由每个等位基因计算。仅显示各个色素的最大值。

结论

DS3000具备基因分型的足够的性能。即使由注入量DNA(125pg)，也可以利用GlobalFiler™ 获得的扩增子来实现分析。然而，对于低注入量DNA (少于125 pg) 获得的分析结果，需要特别注意。

备注

在同类型Spectrum Compact CE System (Promega®, 参考文献2)上，进行了更大规模的验证。DNA分析应在具有丰富的知识和经验的操作员的指导和监督下进行。在进行DNA分析之前，需要在每个研究室进行验证。

材料及方法

准备样品

如表6、表7所示，用GlobalFiler™ Express PCR Amplification Kit (Applied Biosystems™ ) 分析了DNA质控品007。为了测试灵敏度，使用改良后的TE缓冲液(10 mM Tris-Cl，pH 8.0及0.1 mM EDTA-2 Na) 逐次稀释了DNA质控品007。