2023-05-25 19:54:43, Dr.Kong 上海吉凯基因医学科技股份有限公司
自噬是细胞中存在的一种非常关键的“减肥”机制。在饥饿、能量缺乏等代谢应激条件下,细胞会通过自噬来获得新的能量来源和物质需求以维持细胞的基本生命活动。同时自噬还参与多种疾病的发生和发展。大量研究表明,自噬功能障碍与衰老、肿瘤、神经退行性疾病、心脑血管病、代谢糖尿病和自身免疫疾病的发生发展密不可分。由此,揭示自噬在不同疾病中的作用机制并发现靶向自噬功能障碍的药物正成为药物研发的热点领域。
自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡,并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物的过程。待降解的组分形成双层膜结构的自噬小体,通过与溶酶体的融合,完成降解和再利用。在疾病发生的过程中,自噬一般被认为是细胞对外界环境压力的响应,在某些场合能够促进细胞存活,但在另一些场合促进细胞死亡。已有的自噬研究表明,AMPK-mTOR通路在自噬过程中发挥重要作用,通过一系列自噬相关基因(autophagy associated gene, ATG)家族蛋白完成自噬的过程。
根据细胞物质运到溶酶体内的途径不同,自噬分为以下几种。
由内质网、高尔基体或细胞质膜等来源的膜,包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体(autophagosome),并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物;
溶酶体的膜直接包裹待降解物,并在溶酶体内降解;
胞质内蛋白结合到分子伴侣后被转运到溶酶体中,然后被溶酶体酶消化。
CMA 的底物是可溶的蛋白质分子,在清除蛋白质时有选择性,而前两者无明显的选择性。
说起自噬,不得不提的就是LC3蛋白,是微管相关蛋白轻链3(MAP-LC3)的简称,它全程参与了自噬形成,并且也被用作哺乳类自噬作用的标记蛋白,自噬发生初期,胞浆型LC3(即LC3-Ⅰ)会酶解掉一小段多肽,跟磷脂酰乙醇胺(PE)结合,转变为膜型LC3(即LC3-Ⅱ),并且在自噬体上发生聚集。自噬的检测手段包括:1.电镜观察;2.荧光显微镜RFP-GFP-LC3融合蛋白示踪自噬形成;3. WB检测自噬水平。
掌握了自噬研究的基本方法后,我为老师推荐的工具为LC3-GFP-RFP。GFP是酸敏感型GFP蛋白,而mRFP是稳定的荧光表达基团,不受外界影响。由于自噬小体进入第二阶段后,与溶酶体进行融合,形成自噬溶酶体。自噬溶酶体由于溶酶体内部的酸性环境,导致GFP淬灭,因此,GFP的减弱可指示自噬溶酶体形成的顺利程度,GFP越少,则从自噬小体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅。反之,自噬小体和溶酶体融合被抑制,自噬溶酶体进程受阻。mRFP是一直稳定表达的,因而可以通过GFP与mRFP的亮点比例来评价自噬流进程。
1. 对双荧光系统进行了优化和改造,相较于常用荧光蛋白,该系统使用的绿色荧光蛋白Sens-GFP和红色荧光蛋白Stub-RFP 具有高荧光强度,其激发波长分别为488nm和588nm;
2. 绿色荧光标记Sens-GFP对pH值更为敏感,在自噬溶酶体中淬灭更完全;
3. Sens-GFP和Stub-RFP具有更低的细胞毒性,对细胞状态影响更小。
吉凯基因在助力老师们科学研究的道路上,一直走在前沿,想要了解更多自噬的研究思路,欢迎来到5月30日吉凯直播间。
讲座时间
5月30日(周二)
讲座内容
工具病毒在自噬研究中的应用
扫码报名
1.实验技术干货
2.蛋白质组学研究
3.腺病毒简介及应用
6.单细胞测序
8.悬浮细胞专用病毒
10.测序技术研究与应用
12.腺相关病毒选择/应用
13.表观遗传研究
14.文章解析
15.国自然课题设计思路解析
16.生物信息分析及工具
17.外泌体研究
18.肿瘤免疫研究
19.高分文章
20.吉凯病毒神经方向应用案例
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