2023-05-25 13:13:37, 基泰生物 上海基泰生物科技有限公司
Q-TOF将四极杆-飞行管两种质量检测器联用,可以最高进行二级质谱数据的采集(当然,通过源内CID手段,也可以进行假三级质谱的采集),可能是目前药企里面使用最多的高分辨质谱。
一般来说,QTOF应用在蛋白组学和代谢组学,中药复杂成分研究等方面有着显著的优势。
PEG修饰蛋白及多肽类药物后,可在不产生毒性、不损害药效的情况下,通过增加蛋白类药物的溶解性、减少免疫原性、增加稳定性、延长体内药物半衰期等功效增强大分子药物的疗效。PEG的这种功效在1970年代后期被发现,到了1990年PEG化修饰的Adagen被美国FDA批准,至今已有若干个PEG修饰的大分子药物上市销售,这些药物在癌症、肝炎、痛风、糖尿病等疾病治疗中为患者带来了福音。
明确PEG修饰位点、确定修饰位点的数量、以及表征PEG的聚合度分布性是PEG化大分子药物运用于临床前以及药品质量监控必须且非常重要的工作。由于PEG的高分子聚合物性质,由PEG修饰后的蛋白及多肽的结构变得极为复杂。在早期对其进行质谱分析,特别是对PEG的聚合度分布性分析方面,多使用MALDI离子源类型的质谱。这是因为MALDI源离子化的样品,所带电荷数较少(单电荷离子居多),因此其质谱图相对简单;而通过ESI源离子化的样品将携带多个电荷,这使离子信号复杂,致使其质谱图谱较难解析。随着LC-ESI技术的发展, 美国Indiana大学的Lihua Huang等学者通过在色谱分析柱后加胺的技术,使样品的ESI离子化时的荷电数适当减少,从而使PEG化样品的ESI图谱得到高效的解析[1]。而MALDI TOF类质谱由于质谱分辨率的限制(目前MALDI TOF分辨率在8万内),面对分子量动辄十几万甚至更高的PEG化蛋白,其可获得的数据质量较差,因而MALDI方法可得到的PEG化蛋白的有效结构信息非常有限。
Lihua Huang等学者进一步开发了ESI Q-TOF分析P EG化蛋白的修饰位点的质谱方法[2]。这种方法包括源内裂解(ISF,In Source Fragmentation)与二级质谱(MS/MS)两个步骤。在第一步ISF过程中,PEG化多肽的PEG部分被裂解而变短;在第二步MS/MS过程中,多肽被打碎产生b、y离子碎片。通过分析携带缩短的PEG链的b、y离子信息,最终得出确切的PEG化修饰位点。ISF与MS/MS为什么可以分别 “选择”碎裂PEG化多肽的PEG与多肽两个部分呢?推测与PEG化多肽的电荷分布有关。在PEG化多肽的离子化过程中,PEG的醚键附着了大量的H+,并在ISF下完全断裂,而使冗长的P EG链缩短到一两个单位大小。之后的MS/MS过程中,由于缩短的PEG链已无H+附着不再断裂。而多肽在MS/MS中获得了碎裂的机会,并产生携带“PEG短标签”的b、y离子碎片。论文中,研究人员运用此方法成功地分析了IgG4与胰高血糖素的PEG修饰位点。
中药化学成分复杂,寻找中药化学成分快速识别与定性的方法是亟待解决的问题。Q-TOF以其高灵敏度、高选择性、高精密度、高信息采集速度、能够产生多级质谱,获得化合物的元素组成和结构信息等优点,在中药化学成分定性方面有很大的优势。
分析中药化学成分时,首先要分析化合物裂解规律选择诊断离子,通过化合物高质量数精度的一级质谱和二级质谱信息提取可能的化合物,根据裂解规律推测结构。
诊断离子扩展策略结合诊断离子强度分析方法有利于筛选和鉴定具有相同碳骨架的成分,特别是对中药复杂提取物中异构体的分析。
利用诊断离子分析中药化学成分,具有高选择性和高灵敏度的特点。相较于常规的分析方法,无需多次进样,简便快速,能够同时识别发现已知及未知的化合物为中药成分分析提供了新的思路和手段。
在中药分析中,将LC-MS与MN结合,利用液相对中药化学成分进行分离,通过质谱得到化合物的碎片信息,构建MN或利用已有的MN对已知化合物定性鉴别,对未知化合物进行推断和鉴别。尽管MN在中药分析方面具有很大的优势,但MN也有其自身的不足和局限性。目前,MN仍然不能区分立体异构和位置异构,GNPS数据库对中药化学成分的收录相对较少。未来MN的应建立中药全成分质谱数据库,将MN与多种计算机算法整合运用,有利于更多的已知化合物及其类似物甚至新物质鉴定。
当然在中药分析,还有一个利器也不得不提,就是orbitrap,
优势为分离效率高,扫描速度快,可以在很宽的质量范围内生成全扫描数据,精确地采集母离子质核比和碎片离子质量数,有利于中药化学成分的鉴定。
Orbitrap技术可提供更大的扫描间动态范围,但不能改善扫描内动态范围。且测量痕量分析物与高丰度基质化合物共洗脱时,灵敏度将大大降低。Orbitrap未来应集中在弥合扫描内和扫描间动态范围与数据采集速度之间的差距,还需要强大的辅助分析软件和丰富的化合物质谱数据库支持。
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