2023-05-19 16:43:15, Sun Honglin 颇尔(中国)有限公司
呼吸道合胞病毒 (Respiratory Syncyial Virus,RSV) 是一种反式单链RNA病毒,共编码11种蛋白,其中G和F表面蛋白在RSV吸附和融合过程中发挥重要作用,是产生中和抗体最重要的抗原位点,也是诱导机体产生免疫原性和抗病毒的最主要靶点。感染呼吸道合胞病毒会导致黏液分泌增加及发炎,导致气道变窄,是引起婴幼儿、老年人及免疫功能缺陷患者下呼吸道感染的重要病原体。
RSV疫苗研发源自20世纪60年代,福尔马林灭活疫苗 (FI-RSV) 的失败严重打击了RSV疫苗的研发热情,增加了RSV疫苗研发的商业风险,使RSV疫苗研发举步维艰。目前为止,还没有针对RSV感染的预防性疫苗被批准。2022年底葛兰素史克和辉瑞先后公布了积极的RSV疫苗的临床III期数据,给RSV疫苗的研发增加了信心。
目前RSV疫苗的研发主要集中在四大类疫苗,包括减毒活疫苗、病毒载体疫苗、重组亚单位(颗粒)疫苗和核酸疫苗。本文总结了四种类型的RSV疫苗的工艺方案。
01
减毒活疫苗
赛诺菲开发了基于减毒RSV疫苗的生产工艺,此工艺采用Vero细胞进行病毒的扩增,Vero细胞的培养采用含10%血清的DEME培养基,病毒感染MOI为0.001,感染结束后继续培养6天。收获的含病毒料液经过核酸酶处理,过滤澄清,然后经复合模式填料Capto Core 700纯化,以去除宿主蛋白及宿主核酸,此层析步骤的上样量可达10 CV,相对于传统分子筛的常规上样量 (0.01~0.05 CV) 具有显著优势。Capto Core 700的流穿液采用500 KDa的中空纤维膜柱进行浓缩和换液。此工艺整体的回收率为50~60%,层析步骤的收率达到100%,宿主蛋白和宿主核酸的去除率达到99%以上,最终原液中每10 ng VERO宿主核酸病毒含量可达1.1 × 108 PFU 。
02
重组蛋白RSV疫苗
重组蛋白RSV疫苗的表达体系可以是CHO细胞或昆虫细胞。本文以葛兰素史克的CHO细胞表达的重组RSV疫苗为例进行介绍,细胞培养过程采用fed batch模式,细胞培养密度达10-14×106 cells/ml,表达滴度达0.8 g/L,此工艺步骤培养基可以选择ActiPro基础培养基及Cell Boost 7a/7b补料培养基。培养结束后,采用两级的深层过滤以去除细胞碎片等杂质,深层滤器可以采用Stax Disposable Depth Filter PDP8/PDE2类型的深层滤器,然后经过0.2 µm过滤器过滤以降低微生物负荷。
澄清后的料液经过吐温80孵育进行病毒灭活,第一步层析为亲和填料Capto DeVirs对病毒灭活后的料液进行捕获,RSV Pre F蛋白可以与Capto DeVirs结合,大量的宿主蛋白流穿,经过高盐洗脱,蛋白得到提纯并起到浓缩的作用。第二步层析为离子交换层析,采用Capto Q ImpRes高分辨阴离子交换填料,结合洗脱模式用于去除宿主蛋白、宿主核酸,这同时也是病毒清除的步骤。第三步层析为复合模式层析,采用Capto Adhere阴离子与疏水相互作用复合填料的结合洗脱模式,该步骤主要用于去除高低分子量的产品相关杂质和宿主蛋白,另外,还具有有效的病毒清除效果,对于MuLV可以降低4.81个Log,对于MVM可以降低3.15个Log。Capto Adhere洗脱液经过纳滤膜过滤以进行病毒去除,可以选用20 nm的 Pegasus SV4系列滤器。最后再经过50 kDa的超滤膜进行浓缩及缓冲液的调整。
03
mRNA RSV疫苗
mRNA类疫苗工艺包括了质粒模板的制备、mRNA的合成与纯化、LNP的制备及无菌灌装等步骤。质粒的制备工艺可以选择Cytiva的经典三步法工艺和改进两步法工艺:
☞ 质粒工艺:质量何立?
☞ 沉浸式体验质粒两步法纯化工艺
mRNA的合成工艺可以选择Wave或XDR一次性生物反应器进行酶促反应,优化的参数包括DNA模板、NTPs及RNase抑制剂浓度、离子浓度、酶活性、孵育pH、时间及温度等。mRNA纯化工艺一般采用Oligo dT亲和层析进行捕获,去除酶类、NTP及模板DNA等工艺相关杂质,采用高分辨的疏水或离子填料进行精细纯化,去除片段或dsRNA等产品相关杂质。
捕获层析除了用亲和层析,还可以选用复合模式层析填料Capto Core 700/400,葛兰素史克采用Capto Core 700用于自复制mRNA的纯化,相对于其他的工艺方案有更高的回收率及更低的杂质含量。此后,杜克人类疫苗研究所及伊利诺伊大学分别采用Capto Core 700作为mRNA捕获层析的平台工艺。相比于Oligo dT亲和层析,采用Capto Core 700复合模式层析具有如下优点:
载量高,填料使用量少,层析柱规格小
层析缓冲液种类少,层析缓冲液总量少
层析为流穿模式,工艺时间短
层析填料成本更低
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mRNA形式的RSV疫苗依然可以采用Capto Core 700作为捕获层析的填料,在可操作性及成本上都具有显著优势。精细纯化可以选择高分辨的疏水填料,如Capto phenyl ImpRes或Capto Butyl ImpRes,或高分辨离子交换填料,如Capto Q ImpRes或Source 30 Q。
☞ mRNA疫苗的非亲和层析工艺
04
病毒载体RSV疫苗
目前,用于RSV疫苗的病毒载体类型主要有腺病毒载体和痘病毒载体。已批准上市的腺病毒载体新冠疫苗具有较为成熟的生产工艺,以腺病毒载体疫苗为例,病毒生产工艺采用HEK293细胞培养和病毒的感染,细胞培养采用无血清悬浮培养基CDM4HEK293,感染结束后可以用表面活性剂对细胞进行裂解、核酸酶进行宿主核酸的降解,裂解液经深层滤器进行澄清。澄清后料液经300 kDa的中空纤维进行浓缩及换液,而后经过Capto Q ImpRes初步纯化及Capto Core 700精细纯化,层析后料液通过300 kDa中空纤维进行超滤浓缩换液得到最终的疫苗原液。工艺流程图如下图所示。
以上概述了四种类型的RSV疫苗的工艺方案,更多工艺产品和应用解决方案,欢迎登录Cytiva学堂观看课程
课程题目:《疫苗小课堂》
参考文献:
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