NK细胞疗法生产工艺探索

2023-05-19 16:43:15, Cytiva 颇尔（中国）有限公司

NK 细胞是先天免疫系统的一部分，可在无抗体和 MHC 情况下，识别并杀伤肿瘤细胞。因 NK 细胞疗法有助于移植物抗肿瘤反应（GvT），但不引发移植物抗宿主病（GvHD）的特点，受到越来越多的关注。据统计，全球 NK 相关的细胞疗法临床试验数量达 283 个（图 1）。

图 1. 细胞疗法临床试验概览（数据来源Nature Reviews Drug Discovery，截至2022/4/15）

NK 细胞来源主要有：外周血；骨髓或脐带血；多能诱导干细胞（iPS）诱导分化；癌细胞系，如 NK92，NKG，NKL 等。在外周血单个核细胞中 NK 细胞约占 5 %-20 %。经表型 CD3-/CD56+ 定义。因外周血中 NK 细胞数量有限，如何有效分离并扩增至足够治疗剂量成为 NK 疗法的主要技术瓶颈。

本次研究中 Cytiva 开发了一套符合 cGMP 的 NK 细胞制备流程，单次平均可获得大于 10⁹ 个 NK 细胞。经体外培养，NK 细胞纯度＞97%，且经无异源扩增培养后，NK 细胞被有效激活。以下为该临床级别 NK 细胞制备流程的具体描述。

NK 细胞分离

利用全封闭，半自动化的 Sepax C-pro 的 BeadWash 程序，搭配磁力分选系统，自单采血中依次分离表型为 CD3-与 CD56+的细胞。

具体操作

利用 Sepax C-pro 的 BeadWash 程序，共孵育单采血样本与 CD3 磁珠。

输出袋穿刺连接（或无菌接管）至磁力分选系统耗材，利用磁力分选系统进行磁珠分选。

获得的 CD3-组分再次与 CD56 磁珠孵育后分选。以此得到 CD3-/CD56+表型的细胞。

经两步磁珠分选，NK 细胞的纯度从 4%-11% 提升至＞90%（图 2A, B），回收率＞98%（图 2C）。搭配 Sepax C-pro 的 BeadWash 程序，可将原本开放操作的磁珠孵育步骤，优化至封闭式半自动化设备运行。更高纯度的 NK 细胞有利于降低 GvHD，这一点在同种异体疗法中尤为重要。

图 2. 分离后 NK 细胞的纯度和回收率

NK 细胞培养

培养基

HyClone 商品化无异源培养基（1% P/S），NK 活化试剂盒，350 IU/mL Xuri IL-2。

预扩增

初步分离的 NK 细胞在细胞培养板或培养瓶中静置培养，保持 1×10⁶ cells/mL，37℃，5% CO2 培养 6 天。6 天后，调整细胞浓度至 1.5×10⁶ cells/mL 继续培养 2-4 天，直至细胞达到 2×10⁶ cells/mL 至少 500 mL 后，将此时的细胞作为种子，接种至 Xuri W25 细胞扩增系统。

大量扩增

按照 Xuri W25 的操作规程，将预扩增的细胞种子接种至 Xuri 一次性细胞培养袋中，细胞浓度维持 2×10⁶ cells/mL，逐渐添加新鲜培养基，直至总培养体积达到 1L 后，启动灌流培养。每日取样检测细胞密度和活性，灌流速度随细胞密度变化而调整，保证细胞始终有充分的营养环境，且乳酸代谢物水平保持在 25 mM 以下（图 3）。摇摆速度 6 rpm，角度 6 度。

总共 20 天的培养后，NK 细胞总数达到 2.6×10⁹ 至 7.4×10⁹ cells（图 4A）。培养结束时，NK 细胞纯度＞97%（图 4B,C）。表型分析 NK 细胞活化标志物 NKp44（NCR2）和 CD69，证明被激活的 NK 细胞比例从＜5% 上升至＞90%。

图 3. NK 细胞培养灌流策略

图 4. 细胞扩增培养及表型分析

NK 细胞收获

这里我们采用 Sefia S-2000 细胞处理系统，搭配 FlexCell 程序，洗涤回收 NK 细胞。

· 洗涤液：DPBS-/- ，添加 1 mM EDTA 和 2% 热灭活人 AB 血清。

·洗涤程序：2 次洗涤循环，每次离心 400×g，5 min。1L 细胞培养物经洗涤浓缩后，终体积收集 100 mL。

·重悬液：NK 基础培养基。

经洗涤浓缩，细胞的活率约下降 8.5%（图 5A），优化离心条件可改善对细胞活率的影响。表型分析可见，收获前和收获后，NK 表面标志物 NKg2D/NKp44 和 CD69 无明显变化（图 5B）。K562 杀伤试验证明，收获前后，NK 的杀伤能力无明显差别，体外杀伤率＞70%（图 5D）。

图 5A,B. Sefia 回收前后，细胞回收率，活率及表型变化

图 5D. 杀伤试验

NK 细胞冻存和复苏

复苏后，使用 NC-200 设备做细胞计数，NK 细胞活率和回收率＞70%，纯度＞97%，且无 T 细胞残留（图 6A,B）。优化冻存复苏条件，可提高细胞活率和回收率。表型分析证明冻存和复苏对 NK 细胞表型无影响（图 6C）。

图 6. 冻存和复苏

与其他活化方法的对比

Feeder cell。使用 feeder cell 可达到很高的扩增倍数，然而这种方法很难 scale-up。同时 feeder cell 若未被很好的移除，会对病人带来风险。

细胞因子活化。目前，Xuri IL-2, IL-15, IL-21 符合 USP<1043>, 可用于细胞疗法的辅助材料。

这里，为了与上文提到的 NK 活化试剂盒+IL2 的活化方法对比，我们测试了细胞因子组合（350 IU/mL Xuri IL-2, 66.7IU/mL IL-15, 0.341 IU/mL IL-21）的活化能力和扩增效果。结果显示，NK 活化试剂盒 +IL2 的方法可能可获得更高的扩增倍数，但两种方法无明显的统计学差异（图 7）。