lncRNA甲基化与转录组联合分析

随着高通量技术的广泛应用多组学整合分析应运而生，使得生物学发生了革命性的变化，促进了我们对生物过程和分子机制的深刻理解。今天小编给大家介绍的文章是今年3月发表在Theranostics(IF:11.600)上的整合了成对的胶质母细胞瘤甲基化和转录组数据集，揭示了胶质母细胞瘤中DNA甲基化、IncRNA和免疫调控之间的相互作用的文章，快来一起看看吧。

一、背景

胶质母细胞瘤是最常见的恶性中枢神经系统(CNS)肿瘤，其肿瘤微环境(TIME)高度异质性。长链非编码RNA (lncRNAs)的表达可以通过DNA甲基化修饰，其在免疫系统中也逐渐成为重要的调节因子。然而，关于lncRNA的表观遗传变化及其对胶质瘤免疫异质性的贡献的知识仍然缺乏。在这项研究中，作者整合了成对的胶质母细胞瘤甲基组和转录组数据集，并基于lncRNA甲基化特征鉴定了2种免疫亚型并比较胶质瘤不同亚型的免疫特性。此外，还鉴定了免疫相关的lncRNA，并评估了它们与免疫逃避的关系。

二、结果

1.lncRNA甲基化异质性揭示胶质瘤免疫表型

首先作者从TCGA队列中选择了551名同时具有DNA甲基化和转录组谱的胶质瘤患者来研究lncRNA甲基化异质性的程度。通过对可变DNA甲基化的lncRNA的一致性聚类，将癌症患者分型为2个最优簇(C1和C2)并构建了tSNE嵌入聚类来可视化具有lncRNA甲基化特征的聚类，其中C1和C2在两个维度上分开(图1A)，C1组患者既有多形性胶质母细胞瘤(GBM)患者，也有低级别胶质瘤(LGG)患者，C2组则主要由LGG患者组成。接下来，为了研究lncRNA甲基化模式的差异是否暗示肿瘤间免疫异质性和微环境，作者重点研究了源自ImmPort数据库的17条免疫相关通路。DEG分析结果显示，除了TFG-β家族成员和B细胞抗原受体通路外，大部分免疫通路基因在胶质瘤簇之间表现出表达失调(图1B)。基于基因表达的ssGSEA，C1簇中其他免疫通路的活性显著升高(图1B)。此外，作者还估计了胶质瘤患者的抗肿瘤免疫活性评分，包括CYT， MHC和ESTIMATE评分。C1组三种免疫活性评分均显著升高，说明C1组患者具有更强的肿瘤杀伤活性、更强的抗原呈递能力和更低的肿瘤纯度(图1C)。同时C1簇表现出更高的免疫特征活性(图1D)。最后，作者使用TIMER评估胶质瘤患者免疫细胞的相对比例。在B细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞的浸润水平在C1簇中显著升高(图1E)。

在本章节中基于以上结果，作者认为C1集群属于免疫“Hot”表型，而C2集群属于免疫“Cold”表型。并且发现多个免疫细胞的标记基因在簇之间表现出不同的DNA甲基化模式，C1患者表现为低甲基化，C2患者表现为高甲基化(图1F)。

2.胶质瘤免疫表型具有独特的临床和表观遗传学特征

在本章节作者根据几个基本的分子和临床特征进行了免疫亚型的比较分析。在基本的分子特征中发现ATRX以及TERT突变状态、MGMT启动子甲基化状态、1p/19q编码状态、IDH突变状态、WHO分级、组织学诊断和患者年龄呈现不对称分布(图2A)。通过比较生存率，作者发现C1患者的预后比C2患者差(图2B)。通过计算编码区TMB(每个样本的总突变数/ 40Mb)和染色体非整倍性，作者观察到C1集群中这两个特征的总体水平较高(图2C和2D)。然后，作者除遗传变异外，还探讨了表观遗传变异。弥漫性胶质瘤在TCGA队列中根据DNA甲基化被分为6个不同的簇(LGm1-LGm6)。作者发现C1集群富集LGm4-6的全基因组低甲基化，而LGm1-3富集在C2集群(图2E)。同时C1中lncRNA的DNA低甲基化水平明显高于C2集群(图2F)。接下来，作者使用18状态路线图表观基因组ChromHMM模型比较胶质瘤簇之间的DNA甲基化水平。通过BEDTools将450K探针标注为18种染色质状态，并在Roadmap中计算每种脑样品的平均甲基化水平，作者发现活性TSS状态(E01-04)、二价TSS和增强子状态(E14-15)表现出相对低甲基化，而转录(E05-06)、抑制(E12-13、E16-17)和非功能(E18)状态则有较高的甲基化(图2G)，C1组患者在所有18种染色质状态下的甲基化水平都低于C2组。共有119个CRs被鉴定为不同表达(图2H)，其中大多数APOBEC家族被发现在C1簇中上调和共表达(图2I)。

图2 胶质瘤亚型的临床病理和表观遗传学特征

3.表观遗传调控的lncRNA与癌症过程有关

作者结合表达和甲基化数据来鉴定胶质瘤患者中表观遗传调控的lncRNA，发现了149个ER lncRNA的表达与启动子DNA甲基化水平呈负相关(图3A)。这些ER lncRNA在C1和C2簇之间也具有不同的DNA甲基化水平。大多数ER lncRNA(144/149)在启动子区域显示低甲基化，与C2组相比，C1组患者的表达增加。值得注意的是，所有ER lncRNA的甲基化都可以根据其DNA甲基化水平预测胶质瘤患者的预后(图3A)。接下来，作者使用位于ER lncRNA启动子区域的最多1000个低甲基化探针进行eForge分析。CpG位点与路线图脑样品的激活TSS染色质状态(即E1激活TSS)和与转录激活相关的组蛋白修饰(即H3K4me1)相关(图3B)，这进一步证明了lncRNAs通过DNA甲基化激活表达。为了探索ER lncRNA的潜在生物学功能，作者将这些lncRNA分配到离它们最近的蛋白质编码基因(PCGs)上，并进行了共表达分析。大约70%的lncRNAPCG对的表达水平显著相关(图3C)。功能富集分析显示，ER lncRNAs调控的PCGs在免疫调节和神经系统发育过程中显著富集(图3D)。

图3 表观遗传调控的lncRNA与胶质瘤的发展相关

4.与免疫调节相关的表观遗传调控lncRNA

在本节中作者评估了每组胶质瘤患者中ER lncRNA的甲基化/表达水平与免疫细胞浸润之间的相关性。作者保留了表达和甲基化方向相反关系的基因对，总共鉴定出66 ~ 130个与浸润免疫细胞在甲基组和转录组水平上显著相关的lncRNA(图4A)。在表达水平上，正相关lncRNA的数量高于负相关lncRNA的数量。其中有39个lncRNA与所有6个免疫细胞浸润相关(图4B)。作者还发现免疫细胞浸润受到几乎ER lncRNA的正调控，只有ASIC4-AS1表现为负相关(图4C)。为了进一步研究ER lncRNA的免疫调控作用，作者挑选了一个热门的免疫相关lncRNA PVT1，发现PVT1低甲基化，从而在C1胶质瘤患者中表达升高(图4D)。在PVT1高表达和免疫细胞浸润的细胞簇中，PD-L1作为下游靶点与MYC呈正相关(图4E)。这些结果与PD-L1参与T细胞和巨噬细胞的募集并修饰TIME的观察结果一致。接下来，作者估计了ER lncRNA与17种免疫途径的关联，发现与免疫通路相关的ER lncRNA在胶质瘤簇间的分布是不同的(图4F)。在与胶质瘤中所有浸润性免疫细胞相关的39个ER lncRNA中有29个lncRNA参与免疫通路的调控。与免疫细胞浸润一致，大多数lncRNA与免疫通路呈正相关(图4G)。

图4 参与免疫调节的表观遗传调控lncRNA

5.与胶质瘤免疫逃避相关的ER lncRNA

C1组的特征是免疫“Hot”表型，但该组患者的预后比C2组患者差。为了探索这种矛盾现象的可能原因，作者根据PCGs在胶质瘤簇之间表达的折叠变化对其进行排序，并进行GSEA功能分析。除了免疫调节过程外，C1簇中还富集了多个免疫抑制基因集，而C2簇中富集了脑发育过程和组蛋白修饰(图5A)。作者通过TIDE分析发现C1组患者的免疫治疗疗效低于C2组(图5B)。此外，C1组患者的TIDE评分、KLRB1表达和Tregs浸润均显著升高，这表示C1组患者可能发生了免疫逃避(图5B)。作者进一步估计了它们在胶质瘤簇之间的表达和甲基化水平。发现大多数免疫逃逸标记是低甲基化的，因此在C1簇中上调(图5C)，广泛的低甲基化引发GBM细胞的免疫逃逸程序。接下来为了研究ER lncRNA与胶质瘤免疫逃避之间的关系，作者对与免疫细胞浸润和免疫途径相关的29种免疫相关lncRNA与免疫抑制标志物的表达进行了Pearson相关分析。在胶质瘤患者中观察到整体正相关(图5D)。通过分析抗PD1治疗胶质瘤的数据集，发现在免疫治疗应答的患者中，AC131097.3、AL590428.1(CD109-AS1)、LINC02447和LINC01765的表达显著降低(图5E)，这些ER lncRNA的表达水平与其启动子甲基化呈负相关(图5F)，ER lncRNA甲基化比表达数据更能预测预后(图5G)。

图5 鉴定ER lncRNA可作为新的免疫逃避标记

6.体外实验验证内质网lncRNA与免疫逃避之间的关联

这一章节作者在体外实验中验证了ER lncRNA作为胶质瘤新型免疫逃避标记物的能力。首先通过qRT-PCR检测了4种ER lncRNAs (AC131097.3、CD109-AS1、LINC02447和LINC01765)在2个GBM细胞系(U251和U87)中的表达水平，发现CD109-AS1和LINC02447在2个细胞系中均高表达，而AC131097.3和LINC01765则出现缺失(图6A)。因此，作者利用siRNA技术在U251细胞系中敲低CD109-AS1和LINC02447，并测量lncRNA的表达。作者发现，与未转染的亲本细胞相比，siRNA显著降低了lncRNAs的表达，表明慢病毒传递的siRNA序列有效(图6B)。接下来，作者通过CCK8研究CD109-AS1和LINC02447对GBM细胞活力的影响。发现ER lncRNA的沉默延缓了U251细胞系的增殖(图6C)。此外，ER lncRNAs (CD109-AS1和LINC02447)的敲低在蛋白水平上显著抑制了众所周知的免疫逃避标记，包括PD-L1、CTLA4和FOXP3(图6D)。作者采用伤口愈合和transwell实验来探讨ER lncRNA沉默后是否影响细胞迁移和侵袭，发现与对照组相比，敲低ER lncRNAs显著降低了细胞的迁移和侵袭。(图6E、6F)。综上所述，这些结果表明CD109-AS1和LINC02447显著促进胶质瘤细胞的体外迁移、侵袭、增殖，并与免疫逃避有关。

图6 CD109-AS1在GBM细胞系增殖、迁移、侵袭和免疫逃避中的作用

到这里这篇文章小编就介绍完了，本文结构清晰，逻辑严谨，在这项研究中，首先作者使用配对lncRNA甲基化和转录组分析，鉴定出胶质母细胞瘤亚型具有不同的免疫景观，这在免疫途径、免疫活性、特征和时间上都有显著的反映。然后作者同时考虑了胶质瘤亚型之间lncRNA的表达和甲基化水平的变化，鉴定出149个ER lncRNA。ER lncRNA与胶质瘤患者的生存相关，也发现了lncRNA在胶质母细胞瘤免疫相关亚型之间受DNA甲基化调节。接下来作者发现近29种重要的ER lncRNA与免疫逃避标记物的表达相关，其中CD109-AS1和LINC02447在免疫抑制中的潜在作用均在抗PD1治疗和体外实验中得到验证，为胶质瘤免疫治疗提供了新的靶点。

综上所述，本研究基于lncRNA甲基化系统地表征了胶质瘤患者的免疫亚型，并描述了DNA甲基化、lncRNA和免疫调节之间的串扰。通过生物信息学分析和实验验证，首次发现并验证了CD109-AS1和LINC02447两个参与免疫逃避的lncRNA生物标志物，这将促进胶质母细胞瘤免疫治疗靶点的开发。

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