Nat Biotechnol | 引导编辑的双AAV递送体系优化，实现小鼠多组织高效精准编辑

2023-05-15 17:15:27, 木兰之枻

撰文 | 木兰之枻

引导编辑器（prime editor，PE）是一种全新的精准基因编辑工具，其核心组分是nCas9（H840A）与逆转录酶MMLV-RT组合而得的融合蛋白。融合蛋白在改造后的向导RNA（pegRNAs）引导下，可实现目标位点四种碱基的自由替换以及碱基的精准插入与删除【1】 （专家点评Nature | David Liu再出重磅基因编辑新工具，可实现碱基随意转换与增删）。由于绝大多数致病遗传变异都是点突变或插入缺失突变【2】，引导编辑器PE在临床基因治疗研究中的潜力备受关注。为提升引导编辑器PE的编辑效果，研究者对pegRNAs进行了改造，获得的升级版epegRNAs能显著提升编辑效率【3】（Nat Biotechnol | 刘如谦团队改造Prime editing向导RNA（pegRNAs）有效提升精准编辑效率；Cell | 增强Prime Editing基因编辑效果的新思路：细胞内源因子筛选）；研究者还对影响编辑效率的内源因子进行筛选，进一步提升了引导编辑器PE的编辑效率（Cell | 增强Prime Editing基因编辑效果的新思路：细胞内源因子筛选）。研究者还通过双pegRNAs策略提升了引导编辑器PE的碱基编辑效率和精准度【5】（Nat Chem Biol | 伊成器团队开发双pegRNA介导的高效引导编辑系统），还通过改造实现了基因组大片段DNA的删除、替换、整合和倒置【6-8】（NBT背靠背 | 薛文/Jay Shendure分别开发删除大片段的基因编辑技术；NBT | Prime editing的改造与新应用—大片段DNA序列的删除、替换、整合和倒置）。不过目前引导编辑器PE仍面临多种问题，其中体积过大难以拆分极大的限制了其体内应用的前景。

2023年5月4日，美国哈佛大学David Liu实验室在Nature Biotechnology杂志上发表了题为Efficient prime editing in mouse brain, liver and heart with dual AAVs的论文。文章对引导编辑器PE的体内递送体系进行了系统性优化，最终可通过双AAV递送系统实现引导编辑器PE在小鼠体内多组织的高效精准编辑，为其体内广泛应用扫清了障碍。

传统的引导编辑器PE融合蛋白长达2117氨基酸，已超出了很多病毒递送系统的包装能力，甚至难以通过双AAV递送系统进行体内应用。为满足双AAV递送的需求，研究者选择利用内含肽策略对PE融合蛋白进行拆分，发现SpCas9的844和1024位点是优选拆分位点。研究者还对与内含肽直接融合的Cas9 N端截短蛋白末端氨基酸进行突变筛选和优化，发现1024-CFN和844-CFN突变体具有最优的编辑效率。

随后研究者选择1024-CFN拆分体系开展引导编辑器PE3的双AAV体内递送和精准编辑研究。考虑到AAV系统有限的承载能力（~4.7kb），研究者选用EFS启动子和bGH ployA序列介导引导编辑器PE表达，并添加W3序列（WPRE信号的迷你版本）进一步增强蛋白表达效果。PE-AAV表达载体构建完成后，研究者选择AAV9血清型病毒在P0小鼠中通过侧脑室注射（ICV）的方式开展体内Dnmt1基因的编辑研究。结果显示， W3序列能显著提升PE-AAV在小鼠大脑皮层中的编辑能力，该体系也被称为v1 PE3-AAV。之后研究者还采用眼眶后注射（RO）对6-8周龄C57BL/6小鼠进行体内编辑，结果显示v1 PE3-AAV在小鼠肝脏、心脏和骨骼肌中并无明显的编辑效率，因此需要进一步优化。

优化过程中研究者发现，AAV病毒的表达时间对PE编辑效率影响甚微，但pegRNAs骨架优化很有必要：优化后的epegRNAs显著提升了PE-AAV在小鼠肝脏和大脑皮层中的精准编辑效率，该体系也被称为v1e PE3-AAV。研究者还发现，启动子活性对PE-AAV的体内编辑效率同样重要：将EFS启动子替换为Cbh启动子可让PE系统在小鼠肝脏和心脏中的精准编辑效率提升27倍和70倍。此外，将传统的PE替换为优化后的PEmax可获得编辑效率更高的v2em PE3-AAV体系。

v2em PE3-AAV需要通过三AAV进行递送和体内应用，因此仍需要改造和优化。研究指出，删除MMLV-RT蛋白的RNaseH功能域并不影响PE系统的编辑活性，由此研究者获得了可通过双AAV系统进行体内应用的新体系v3em PE3-AAV，其在小鼠肝脏、心脏和骨骼肌中的编辑效率高于v1em/v2em PE3-AAV，在小鼠大脑中的编辑效率则与v1em PE3-AAV相近。

最后研究者利用优化后的v3em PE3-AAV体系并结合双AAV递送系统，在小鼠大脑皮层/海马神经元以及肝脏细胞中分别实现了APOE3 R136S和PCSK9 Q152H保护性点突变的高效精准编辑。研究者还证实，双AAV系统介导的v3em PE3-AAV体内编辑体系并无明显的脱靶风险和毒性效应，证实了新体系的有效性和安全性。

总体而言，本研究设计的直接拆分策略和体系优化对引导编辑器PE的广泛应用意义重大，为PE的体内应用打下了坚实的基础。

原文链接

https://doi.org/10.1038/s41587-023-01758-z

制版人：十一

参考文献

1. Anzalone, A. V. et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature 576, 149–157 (2019)

2. Rees, H.A. & Liu, D.R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nat Rev Genet (2018).

3. Nelson, J.W., Randolph, P.B., Shen, S.P., Everette, K.A., Chen, P.J., Anzalone, A.V., Newby, G.A., An, M., Chen, J.C., and Liu, D.R. Engineered pegRNAs that improve prime editing efficiency. Nat. Biotechnol. (2021).

4. Chen P.J., Hussmann J.A., Yan J., Knipping F., Ravisankar P., Chen P.-F.et al. Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes. Cell. 2021; : 184

5. Zhuang, Y., Liu, J., Wu, H. et al. Increasing the efficiency and precision of prime editing with guide RNA pairs. Nat Chem Biol (2021).

6. Choi, J. et al. Precise genomic deletions using paired prime editing. Nat. Biotechnol. https://doi.org/10.1038/s41587-020 (2021).

7. Jiang, T., Zhang, XO., Weng, Z. et al. Deletion and replacement of long genomic sequences using prime editing. Nat Biotechnol (2021).

8. Anzalone, A.V., Gao, X.D., Podracky, C.J. et al. Programmable deletion, replacement, integration and inversion of large DNA sequences with twin prime editing. Nat Biotechnol 40, 731–740 (2022).