【基因编辑】探索赛默飞的基因编辑技术如何简化gRNA和实验设计

2023-05-09 20:33:13, 赛默飞生命科学赛默飞世尔科技生命科学产品

近年来，科学家可用的基因编辑解决方案工具箱有所发展，能够对一系列应用进行更有效的编辑。基因组工程并非最近发生的事情，其起源可以追溯到几十年前，目前科学的发展已远不止锌指核酸酶的使用，在朝着更快、更简单和更有效的技术方向发展，例如转录激活因子样（TAL）效应物核酸酶（TALEN）和CRISPR-Cas9基因编辑方法。其中一项技术—CRISPR基因编辑，已成为人类最强大的技术之一，有可能改变我们创造能源、生产食品、优化工业加工以及检测、预防和治疗疾病的方式。目前，下一代CRISPR-Cas9工具允许研究人员以高度特异和可靠的方式靶向几乎任何需要修饰或缺失/沉默的基因。

在本文中，我们着眼于设计一项成功和精确CRISPR基因编辑实验的关键考虑因素。此外，我们还将展示Thermo Fisher Scientific的Invitrogen™ TrueDesign™ Genome Editor软件和相关工具如何帮助支持您基因编辑工作流程中的每一步

设计CRISPR实验时需要考虑的事项

图1. CRISPR gRNA、Cas9蛋白和CRISPR-Cas9系统

CRISPR基因编辑系统包含两个关键组件，一个向导RNA（gRNA）和CRISPR相关的内切酶，通常采用Cas9。gRNA含有约20个核苷酸长度的用户定义间隔序列，允许Cas蛋白靶向值得关注的基因。靶DNA序列也是一个重要的考虑因素，因为它必须位于一个短DNA基序的上游（该基序被称为gRNA:Cas复合体的前间隔序列邻近基序（PAM）），以切割基因组DNA。因此，在考虑可用的PAM基序以及gRNA序列和靶序列精确匹配的情况下，选择最佳靶位点对于基因编辑的成功至关重要。

无论您是在标准细胞系中进行常规的CRISPR-Cas9编辑，还是尝试在原代细胞或诱导性多能干细胞（iPSC）细胞系中进行需要最大靶向效率的专业编辑，每种方法均需仔细考虑实验设计和构建。Thermo Fisher Scientific提供了一套全面的基因编辑工具来支持基因编辑工作流程的每个阶段，从为您选择的基因靶标设计向导RNA（gRNA）到递送和下游表征。

图2.典型的基因编辑工作流程可分为三个主要阶段：1）设计与构建；2）递送；3）检测与验证。从gRNA设计和细胞转染试剂到遗传分析和表型分析解决方案，Thermo Fisher Scientific为整个工作流程提供基因组编辑解决方案。

开始实验之前：

考虑为每个靶标设计和测试三个gRNA。
使用TrueDesign基因组编辑设计工具（TrueDesign Genome Editor）软件等工具，运行生物信息学分析以选择具有最小预测脱靶效应的gRNA。
对于敲除实验，靶向早期组成型外显子以破坏阅读框架。
对于敲入实验，切割位点应尽可能靠近编辑位点（＜10 bp，如可能），应优化供体同源臂的长度。TrueDesign Genome Editor可以自动为您的敲入实验设计定制的同源臂。
选择最适合实验和细胞类型的Cas核酸酶。

Invitrogen TrueDesign Genome Editor软件将所有这些标准均考虑在内，让您设计基因编辑实验的压力显著降低。

下载Invitrogen基因组编辑资源指南

获取更多提示和技巧

Thermo Fisher Scientific的Invitrogen™ TrueGuide™合成向导RNA提供了一种预先设计的CRISPR sgRNA，其通过选择具有最佳特异性的高敲除效率算法产生。对于定制的gRNA，Invitrogen TrueDesign Genome Editor可轻松进行设计，并可选择和订购正确试剂。

2023年4月25日-6月30日，更可以申请领取试用装，• 通过扫二维码进入“赛默飞干细胞好物申领季”活动页面,每个信息人只能申领一种产品试用装，数量有限，先到先得，发完即止。

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Invitrogen™ TrueCut™ Cas9 v2

(货号: A36496)

具有超高编辑效率的新一代野生型 Cas9蛋白

卓越的编辑效率 — 在所有测试过的细胞（包括原代细胞、干细胞和免疫细胞）中始终如一的高靶向编辑效率
卓越的性能 — 对困难靶点的编辑效率相比竞争对手高达 2 倍
高品质 — 严格按照 ISO 13485 质量标准制造

Invitrogen™ TrueCut™ HiFi Cas9

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兼具低脱靶效应与高靶向编辑效率的Cas9蛋白变体

更高的特异性 — 显著降低包括原代细胞、干细胞和免疫细胞在内的多种细胞类型的脱靶效应
高编辑效率 — 保持野生型 TrueCutCas9 蛋白 v2 的高靶向编辑效率
高品质 — 严格按照 ISO 13485 质量标准制造

使用TrueDesign Genome Editor设计基因编辑实验

TrueDesign Genome Editor软件是一个免费的在线工具，可让各种经验水平的研究人员轻松进行设计，并选择和订购试剂，以便在人类、小鼠、大鼠、斑马鱼和蛔虫五种不同种属中进行准确和成功的基因编辑实验。

该软件支持七种类型的基因编辑：基因敲除、基因敲入、荧光标记、表位标记、替换、删除和SNP创建。它遵循简单的三步工作流程，在该流程中，选择您的基因和转录本，指定您的编辑，然后根据软件的建议设计您的CRISPR靶标。对于每一种设计，软件均会编制一份成功编辑所需材料和试剂的清单，并方便地从同一来源订购，确保其彼此出色匹配。

基因敲入：TrueDesign Genome Editor案例研究

尽管基因敲除已经实现了几年，但由于同源定向修复的低效率，基因敲入仍然存在问题且难以实现。要成功完成敲入，依赖于供体DNA的精确设计、sgRNA和Cas9复合体的有效性以及递送到靶细胞中的效率。查看本应用说明，了解如何使用TrueDesign Genome Editor改进和简化基因敲入的设计，其将单核苷酸多态性（SNP）和荧光标签引入诱导性多能干细胞（iPSC），编辑效率高达100%。

作为该种方法的范例之一，Kim等人（2022年）在Nature Communications杂志上发表的研究基于葡萄糖感应和可用性剖析了亮氨酸代谢。韩国首尔延世大学的团队采用Thermo Fisher Scientific的TrueDesign Genome Editor设计sgRNA和供体DNA，使用CRISPR和TrueCut™ Cas9蛋白v2生成LARS1 S1042A敲入细胞，并证明该酶在葡萄糖饥饿时亮氨酸代谢中扮演重要的调节作用。该研究证明了CRISPR-Cas9技术有助于揭示复杂的细胞代谢，能够研究、改变、创建和再创建高度复杂的通路、DNA序列和基因。

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参考文献：

Kim, K., Yoo, H.C., Kim, B.G., Kim, S., Sung, Y., Yoon, I., Yu, Y.C., Park, S.J., Kim, J.H., Myung, K., Hwang, K.Y., Kim, S.& Han, J.M.亮氨酸-tRNA合成酶1的O-GlcNAc修饰整合亮氨酸和葡萄糖的可用性调节mTORC1和亮氨酸的代谢归宿。Nature Communications 13(1):2904; 2022年5月25日。DOI:10.1038/s41467-022-30696-8。PMID:35614056；PMCID:PMC9133088。

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