Sci Adv丨李祥课题组开发多功能核小体表征染色质介导的蛋白质相互作用
2023-05-06 13:50:54, BioArt
![]()
当被问2米有多长？人们可能首先想到COVID-19大流行期间的安全社交距离，也可能想到姚明的身高。很少会有人知道，2米也可以是人类基因组DNA分子的长度。基因组DNA被逐级压缩折叠以最终染色质的形式存储在只有0.00001米直径的细胞核中。尽管DNA被压缩了将近106倍，但是它却依然能精确有序地调控几乎一切DNA相关的生命活动。事实上，DNA的生物功能受到多种染色质结合蛋白的调控，包括催化DNA和组蛋白上表观遗传修饰的书写器"writer"或擦除器"eraser"，识别和翻译表观遗传标记的阅读器“reader”，以及协调组蛋白沉积和核小体组装的组蛋白伴侣和染色质重塑蛋白。因此，染色质结合蛋白在诸如基因转录、DNA复制和损伤修复等以DNA为模板的生物活动中起着关键作用。染色质结合蛋白的功能异常或失调往往导致癌症等疾病，这凸显了全面、系统的鉴定和表征染色质结合蛋白的必要性 【1，2】。目前有主要两种策略来鉴定染色质结合蛋白：‘top-down’ 和 ‘bottom-up’ 。‘top-down’从细胞中提取染色质，利用染色质免疫沉淀（ChIP）等方法对染色质结合蛋白共纯化并鉴定。虽然该方法可以全面鉴定原生条件下的染色质结合蛋白，但由于技术的局限性，并不能区别直接结合和间接结合的蛋白 【3】。‘bottom-up’方法利用DNA或者组蛋白片段作为"诱饵 "来富集特定的结合蛋白。但这种片段化的“诱饵”缺少染色质结构特点，因此该方法只适用于寻找识别组蛋白非球面区域的染色质结合蛋白（图1）【4】。此外，染色质结合蛋白与染色质的作用微弱且短暂，这导致在pull-down实验中极易丢失结合蛋白。同时，除了鉴定染色质结合蛋白外，还需要了解染色质是如何被特定蛋白所识别，以确定负责识别的结合口袋。为了解决上述问题，香港大学李祥团队开发了化学合成多功能核小体探针的新方法。近日，Science Advances发表了团队的研究：Development of multifunctional synthetic nucleosomes to interrogate chromatin-mediated protein interactions，开发了多功能核小体表征染色质介导的蛋白质相互作用。![]()
作为组成染色质的基本重复单元，该方法所合成的核小体拥有多功能光亲和基团，其不仅可以从复杂的蛋白质组中表征染色质结合蛋白，还可以在鉴定核小体依赖的蛋白相互作用中的结合位点信息。核小体探针包含可实现光交联的双吖丙啶（diazirine），可通过点击化学（click chemistry）富集、分离交联蛋白的炔基（alkyne），以及可用于释放交联肽进行质谱分析的二硫键（图1）。制备核小体探针的基本思路是利用半胱氨酸化学（例如半胱氨酸烷基化，硫交换等）首先制备带有多功能光亲和基团的组蛋白。再利用核小体体外重组手段，最终得到核小体探针。基于此，研究团队首先分别在多肽和蛋白层面表征、优化了半胱氨酸化学反应。结果表明，经过反应条件优化，半胱氨酸烷基化和硫交换方法均可高效的制备目的探针，然而硫交换反应的产率明显高于烷基化反应，且一个当量的Npys-Dzyne原料足以实现底物的完全转化 （图2）。利用优化后的条件，研究团队合成了一系列多肽和蛋白探针，并且所有合成的探针均展现了其有效捕捉结合蛋白的能力。HMGN2是已知的核小体结合蛋白，该结合通过自身的NBD区域与核小体酸性区域所介导【5】。然而具体的分子机制还不清楚。研究团队利用硫交换制备了HMGN2蛋白探针，并利用质谱技术绘制了HMGN2与核小结合的分子机制。结果发现，HMGN2的第30位的赖氨酸与核小体酸性区域的H2A D90 和 H2B E102氨基酸结合，以稳定HMNG2-核小体复合物。后续的荧光共振能量转移（FRET）验证了上述发现 （图2）。染色质结合蛋白与染色质的结合往往会依赖于核小体的高级结构。例如，组蛋白H3K79的甲基转移酶DOT1L。组蛋白H3的K79 位于核小体的球面区域，该区域不同于组蛋白末端，具有蛋白高级结构。而DOT1L与K79的结合依赖这些高级结构，导致DOT1L仅可以识别完整核小体中的H3K79，而不是H3 片段 。因此，一直以来，由于缺少核小体探针，对于该位点的结合蛋白研究非常匮乏。研究团队利用半胱氨酸化学方法制备了一系列核小体探针，最终经过筛选得到了可以高效捕捉DOT1L蛋白的核小体探针N1 和 N2（图3）。利用所得到的核小体探针，实验团队在多角度研究了DOT1L不同位点突变对于其与核小体结合的影响以及探究了DOT1L-核小体复合物active 和 poised 状态的转变。此外，结合质谱技术，研究团队描绘了DOT1L与核小体结合的分子机制。总的来说，这些表征证明了所开发的多功能核小体探针在鉴定核小体依赖的染色质结合蛋白中的应用前景。最后，结合团队之前所开发的CLASPI技术，研究团队利用核小体探针系统鉴定了核小体酸性区域的结合蛋白。所鉴定出的蛋白中，包括了已知的酸性区域结合蛋白SMARCB1。此外，研究发现了两个新的结合蛋白OARD1和LAP2a，其均在后续的体外光交联验证实验中展现出了和核小体的结合能力。综上，研究团队开发了一种强大的蛋白质标记方法用于制备多功能核小体探针。该系列探针完整的保留了蛋白的高级结构信息，并且可以高效的鉴定结构依赖的一系列蛋白相互作用，包括表观遗传修饰介导的蛋白相互作用、组蛋白相互作用、酶-底物相互作用、蛋白-核小体相互作用。此外，结合质谱技术，这些探针可用于绘制蛋白-核小体相互作用的结合区域，作为蛋白-核小体复合体的分子机制研究的补充手段，尤其是对于缺少冷冻电子显微镜和X晶体射线信息的蛋白复合体。在文章最后，研究团队远景，其所开发的核小体探针制备方法，在染色质生物学和表观遗传学研究中得到广泛的应用。据悉，香港大学化学系李祥教授、刘政博士为该文章的共同通讯作者。同时，刘政博士与吴怡萍博士为该文章的共同第一作者。李祥教授课题组长期从事表观遗传学、化学蛋白质组学、化学生物学等相关研究，欢迎对上述学科感兴趣的同学加入李祥实验室！实验室长期招聘生物、化学相关博士后研究员、博士生、科研助理等岗位。有意者请将个人简历及相关材料进行投递。https://jinshuju.net/f/ZqXwZt或扫描二维码投递简历http://doi.org/10.1126/sciadv.ade5186制版人：十一
1. S. B. Baylin et al., Nat Rev Cancer 11, 726-734 (2011).
2. K. Helin et al., Nature 502, 480-488 (2013).
3. P. J. Park et al., Nat Rev Genet 10, 669-680 (2009).
4. X. Li et al., Acc Chem Res 54, 3734 (2021).
5. J. E. Kugler et al., Proc Natl Acad Sci U S A 108, 12283-12288 (2011).
![]()
【非原创文章】本文著作权归文章作者所有，欢迎个人转发分享，未经作者的允许禁止转载，作者拥有所有法定权利，违者必究。
![]()
